Самая новая лада 2018: LADA Granta седан — Официальный сайт LADA

Напомним, о том, что региону остро необходим редкий прибор, стало известно во время визита детского омбусдмена Анны Кузнецовой. О готовности приобрести аппарат буквально в течение пары часов заявил президент фонда развития региона имени Манякина Степан Бонковский. Этот поступок оценили далеко не все. В областной избирком поступила жалоба.

«Когда речь идет о спасении жизни ребенка, нужно действовать оперативно, Степан Степаныч поступил по-военному, оперативно решил проблему и считаю, что здесь не имело место подкуп, а здесь было спасение жизни ребенка», — отметил депутат Государственной Думы РФ Дмитрий Перминов.

Действовать в таких ситуациях, когда речь идет о жизни и здоровье, нужно максимально оперативно, подтвердила и врач-педиатр Елена Павлинова. Зачастую медикам нужно в кратчайшие сроки поставить верный диагноз. Сейчас определить уровень аммиака в крови в регионе нельзя. Техники нет. Хотя в год в Омской области рождаются 3-4 ребенка с подобными диагнозами. Проявляется болезнь тяжелым состоянием вплоть до комы. Впрочем, скоро все изменится. Аппарат поставят в регион в течение пары месяцев. Сейчас готовятся необходимые документы.

«Аппарат дорогостоящий, он японского производства. Это достаточно большое значение имеет для ведения таких пациентов. И не только с этим заболеванием. Но и других пациентов, поступающих прежде всего в отделение интенсивной терапии. Это исследование проводится в кратчайшие сроки, непосредственно у постели больного, поэтому, естественно, прежде всего заинтересованы отделения интенсивной терапии в оснащении этими приборами», — рассказал заведующая кафедрой госпитальной педиатрии Омского государственного медицинского университета Елена Павлинова.

В поддержку Бонковского высказалась и Ольга Коптева. Дочь женщины — Настя — страдает СМА — спинально-мышечной атрофией. В 2018-ом вердикт врачей стал для семьи приговором. Болезнь прогрессирует и девочке срочно нужны индивидуальный аппарат искусственной вентиляции легких и специальный откашливатель. Купить оборудование сами Коптевы не могли, так как стоимость приборов огромная. Помог фонд развития региона имени Манякина. Женщина назвала возможное снятие Бонковского с выборов несправедливостью.

«У нас у дочери СМА, и имея такой диагноз, нужна помощь.И если обращаешься к человеку и он просто помогает, он помог не каким-то друзьям, я к нему пришла человек с улицы», — отметила жительница поселка Москаленки Ольга Коптева.

Сейчас Коптевы как могут, борются за жизнь дочери. И даже боятся представить, что было бы, если бы так нужные приборы не были приобретены вовремя.

Фото: 12 канал

Подписаться на канал Яндекс.Дзен

Подписаться на канал Телеграм

Taylor 322CE 12 Fret 2018 Grand Concert Acoustic Electric |

Артикул: USTO322CE12FT

Приобретенная непосредственно у Taylor Guitars, эта гитара звучит великолепно, находится в отличном состоянии — точно как новая, чистая, без дефектов и по цене, которую можно двигать … Грифы Taylor с 12 ладами немного короче Длина в масштабе 24-7 / 8 дюймов Grand Concert и переставленный мост, который находится ближе к центру нижней части схватки. Результатом является более тонкое ощущение руки, которое упрощает формирование аккордов и изгиб струн, а также тональный отклик, который может похвастаться удивительной мощностью, теплотой и сустейном для меньшего корпуса.Задняя и боковые панели из черного дерева создают сильный акцент на средних частотах с всплеском верхнего мерцания, в то время как верх из красного дерева помогает выровнять тональный отклик. Среди других отличительных особенностей — верх с заштрихованными краями, полностью сатинированная отделка, небольшие алмазные вставки из итальянского акрила, венецианский вырез и звукосниматель Taylor’s Expression System 2.

Серийный номер 1105188040

• Тропическое красное дерево с затененной кромкой Burst Top
• Performance Bracing с разгрузкой
• Три кольца, белая и черная розетка Soundhole в тонкую полоску
• Черная накладка
• Белая и черная отделка сверху в тонкую полоску
• Tasmanian Blackwood Средне-коричневое пятно на оборотной стороне и по бокам
• Ширина нижней части (15 дюймов) при глубине корпуса (4 3/8 дюйма)
• Черный переплет
• Венецианский разрез
• Тело и шея с атласной отделкой
• Стандартный вырезной гриф из красного дерева в тропическом стиле
• Длина шкалы 24 7/8 дюйма (общая длина 38 дюймов)
• Гайка клыка шириной 1 3/4 дюйма
• Ebony 18 Fret 15-дюймовая накладка на гриф
• Итальянский акриловый жемчуг Инкрустация «Мелкие бриллианты»
• Тюнеры Taylor со слот-головкой и кнопками Ivoriod
• Мостик из черного дерева с компенсированным седлом из микарты
• Булавки моста из черного дерева
• Taylor Expression System 2 (ES-2) Акустическая электроника
• Elixir (16052) Набор светочувствительных струн из фосфорной бронзы

• Taylor Deluxe Grand Concert Темно-коричневый жесткий футляр

Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и т. Д. vivo imaging

Конструирование плазмиды

Комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая mTurquoise, и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart ⁴³ .кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены сайт-специфическим мутагенезом с помощью ПЦР. Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) ⁴³ и K206A (для Turquoise2-GL). Прототип ERK-биосенсора активности FRET, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно ¹⁹ . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP.Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan). Точно так же CFP в PicchuEV-x ^19,44,45 и RaichuEV-Ras ^19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 для образования hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно.В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов. Варианты hyBRET-ERK NanoLuc также были получены реакцией In-Fusion. CeNL, гибридный белок Turquoise2 и NanoLuc, был описан ранее ²² .Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, были субклонированы в вектор pCAGGS ⁴⁷ или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) ⁴⁸ . Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки кДНК-кодирующих компонентов hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) и кодон-оптимизированным YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP ⁴⁹ . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK был заменен на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК. Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена ​​в вектор CSII-EF с IRES-puro, и кДНК для голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были амплифицированы с помощью ПЦР и субклонированы в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов.pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее ⁵⁰ . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion. Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548–1020) или интер-Sh3 доменом p85 человека (aa 428–621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 ⁵¹ .Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена ​​перед последовательностью поли А. Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.

Клеточная культура и создание стабильных клеточных линий

Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония).Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония). Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере 5% CO2 на воздухе при 37 ° C.Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase ⁴⁸ , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute. Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем культивировали дополнительно в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T котрансфицировали вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида # 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком доктора.Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Warrington, PA). Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.

Реагенты

Диацетилцелентеразин-h синтезировали, как описано ранее ¹⁴ .Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония). Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и фактор роста эпидермиса были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использовался для липофекции плазмиды в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина.Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.

Спектроскопия

Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор помещали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock).YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus). Спектры флуоресценции регистрировали с интервалом 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12.Полученные спектры флуоресценции и люминесценции были использованы для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.

Оценка эффективности передачи энергии

Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны к теоретическим спектрам излучения, по существу, как сообщалось ранее ²⁰ . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон).Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:

$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$

(1)

где F ( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε _c ( λ _из ) — коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E _CY — КПД FRET между CFP и YFP, ϕ _C — квантовая эффективность CFP, f _C ( λ ) — нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ _Y — квантовая эффективность YFP, f _Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε _Y ( λ _из ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения.Модель ε _Y ( λ _из ) значение на 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP ​​в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε _Y ( λ _из ) значение при 513 нм.

Если предположить, что слияние RLuc8 на С-конце в кадре не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:

$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} — {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$

(2)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _RC — эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E _RY — эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ _R — квантовая эффективность RLuc8, а f _R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.

E _CY был оценен путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к формуле. 1. E _RC считается постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E _RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ _CNL , выражается следующим уравнением:

$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$

(3)

Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E _RC было определено как 0,13. Наконец, E _RY был оценен путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.2. Значения ε и ϕ перечислены в Таблице S1.

Скорости передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.

$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$

(4)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _NC — эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NY — эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ _N — квантовая эффективность NanoLuc, а f _N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc.Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NC , был также оценен по формуле. 4, установка E _NY и E _CY как ноль.

Покадровая визуализация культивируемых клеток

Покадровая съемка была получена и обработана с использованием, по существу, тех же условий и процедур, что и ранее. ⁵² .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом в процессе покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см ² в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить паразитный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25×36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Для визуализации BRET не использовалось дихроичное зеркало.

Обработка изображений

Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума ⁵³ . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.

Optogenetics

Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать транслокацию через мембрану слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом с длиной волны 490 нм (55 мкВт / см ² ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см ² ) или светом 490 нм (180 мкВт / см ² ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).

Анализ на микропланшетном ридере

Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разбавленным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью считывающего устройства для микропланшетов GloMax Discover (Promega).Фильтр короткого прохода 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $

(5)

Здесь SD — это стандартное отклонение, а Ave — это среднее значение желтого / голубого люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее ²⁶ . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$

(7)

Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK — это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.

Образование опухоли ксенотрансплантата и генерация трансгенных мышей

Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 ⁶ клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 ⁵ клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенные мыши были получены с помощью Tol2-опосредованного переноса гена ⁵⁴ . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.

Биолюминесцентная визуализация всего тела животных

Для сравнения продолжительности жизни биолюминесценции между аналогами целентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для люминесцентной визуализации мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. / Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время воздействия 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.

Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши

Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому аппарату ИВЛ MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%. Чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием, обнаженную область левого легкого осторожно отсосали и зафиксировали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был подключен к вакуумному насосу. Опухоли в легких получали с помощью вертикального микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного водно-иммерсионным объективом XLPlanN 25x (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. В качестве дихроичных зеркал использовали DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Используемые фильтры выбросов: FF01-425 / 30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET, соответственно. Во время FRET-визуализации мышам внутривенно вводили 5,0 мг / кг ^-1 PD-0325901 без прерывания визуализации.

Анализ резонансного переноса энергии флуоресценции β-секретазы на основе струйной печати для скрининга потенциальных ингибиторов β-секретазы при болезни Альцгеймера

Амилоид-β (Aβ) образуется в результате протеолитического процессинга белка-предшественника амилоида (APP) бета-секретазой (BACE-1) и гамма-секретазой.Амилоид-β отвечает за образование сенильных бляшек при болезни Альцгеймера (БА). Следовательно, ингибирование β-секретазы (BACE-1), фермента, ограничивающего скорость продукции Aβ, представляет собой привлекательный терапевтический подход к лечению AD. В этой статье описан флуоресцентный анализ на основе струйной печати для высокопроизводительного скрининга ингибиторов β-секретазы, достигнутый с помощью субстрата BACE-1 FRET (Rh-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Lys-Quencher ). Известно, что этот пептидный субстрат является легкодоступным и подходящим субстратом для протеолитической активности, и он имеет высокое сродство к ВАСЕ-1.Пептидный субстрат ВАСЕ-1, напечатанный на пергаментной бумаге, эффективно расщеплялся ВАСЕ-1, который был напечатан на том же самом месте. Количество фермента и субстрата, необходимое для этого анализа BACE-1 на основе струйной печати, может быть менее 1,4ⅹ10 ³ , что позволяет оценить активность ингибитора с фемтомолярной эффективностью. Анализ ингибирования ВАСЕ-1 на основе струйной печати выявил ингибирующие эффекты ингибитора IV и STA на ВАСЕ-1 с IM ₅₀ 1,00 × 10 ^-15 моль и 1.01 × 10 ^-14 мол соответственно. Эти данные подтверждают, что оба ингибитора ВАСЕ-1 (ингибитор IV и STA) активно ингибируют протеолиз ВАСЕ-1 субстрата ВАСЕ-1 на пергаментной бумаге. Важно отметить, что количество молей BACE-1-субстрата и фермента, используемых в ферментативном анализе на основе печати, на 1,4ⅹ10 ³ меньше, чем количество, используемое в обычном анализе на планшете с лунками. Анализ ингибирования на основе струйной печати представляет собой универсальный высокопроизводительный метод, и значения ингибиторов IM ₅₀ были получены с удовлетворительной воспроизводимостью, что позволяет предположить, что этот анализ ингибирования BACE-1 для струйной печати может быть вполне подходящим для проверки новых потенциальных возможностей. Ингибиторы ВАСЕ-1 при АД.

Ключевые слова: Амилоид-β; FRET; Ингибитор; Струйная печать; Пептидный субстрат.

Биологические перспективы pH-зонда на основе FRET, демонстрирующего работу молекулярного логического элемента при изменении pH

Мониторинг внутриклеточного pH — мощный инструмент для понимания множества клеточных функций и прогноза многих заболеваний. В этом исследовании был приготовлен эффективный многофункциональный кислый pH-чувствительный зонд 1 , основанный на резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET) посредством связывания родамина B в качестве акцептора FRET и нафталимидного флуорофора в качестве донора FRET с использованием 1 , 4-диаминобутан в качестве неконъюгированного линкера.Морфолин был добавлен в качестве потенциальной целевой группы для лизосом к нафталимидному фрагменту. Зонд имеет селективное переключение излучения с зеленого на красный в диапазоне pH от нейтрального до кислого (от pH 7,0 до pH 4,0), тогда как он, по-видимому, остается неизменным в основной среде с наблюдаемым p K _a ∼4,80. Кроме того, зонд 1 можно использовать для создания логического элемента INHIBIT и соответствующей дополнительной логической схемы, применяя ионы H ⁺ и OH ^— в качестве входных сигналов на основе спектральных изменений поглощения и излучения, соответственно.Зонд показал эффективную склонность к связыванию с CT-ДНК ( K _b = 1,34 × 10 ⁵ M ^-1 ), что свидетельствует о частичной интеркаляции через плоские фрагменты между парами оснований ДНК. Он также показал сильную аффинность связывания с белком бычьего сывороточного альбумина (BSA) ( K _BSA = 1,74 × 10 ⁶ M ^-1 ) с эффективным гашением флуоресценции триптофана (97%). при λ _em = 345 нм.Интересно, что нафталимидный флуорофор, являющийся эффективным фотосенсибилизатором, позволяет зонду демонстрировать эффективное фоторасщепление ДНК под действием УФ-А света ( λ = 312 нм) с 65% -ной конверсией сверхспиральной (SC) ДНК в ее кольцевую (NC) форму ДНК с разрывами . через фотогенерация активных форм кислорода (АФК) в микромолярной концентрации в физиологических условиях.

У вас есть доступ к этой статье

Рынкам еще есть о чем беспокоиться

15 февраля 2018 г.

Ваш браузер не поддерживает элемент

Слушайте на ходу

Загрузите приложение Economist и играйте в статьи, где бы вы ни находились

Рынки BULL всегда поднимаются на стену беспокойства, по крайней мере, так говорится. На протяжении большей части 2017 года основные опасения были политическими, и рынки, казалось, преодолевали их так же легко, как собака-робот открывает двери (последняя интернет-сенсация).

Но февраль показал, что рынок по-прежнему уязвим. Непосредственным спусковым крючком, похоже, стали опасения, что инфляционное давление вызовет рост доходности облигаций, а центральные банки — к повышению процентных ставок; Удивительно высокие показатели инфляции в США на этой неделе только усилят беспокойство.В узком смысле это делает облигации более дешевыми по сравнению с акциями. В более широком смысле он увеличивает ставку дисконтирования, которую инвесторы применяют к будущей прибыли, снижая текущую стоимость акций. (Необходимо сделать оговорку: если более высокие ставки отражают более сильный рост, тогда оценки будущей прибыли должны вырасти, компенсируя эффект дисконтной ставки.) после многих лет, в течение которых можно было с уверенностью предположить, что ставки останутся низкими.Это приводит к более волатильному рынку, о чем свидетельствует резкий скачок Vix, или индекса волатильности, в начале февраля.

Опасность заключается в том, что многие инвесторы, похоже, рассматривают волатильность как класс активов и соответствующим образом организовывают свои портфели. Эрик Лонерган из M&G, группы по управлению фондами, предупредил в своем блоге, что «эндогенная нестабильность растет, и в ее основе лежит волатильность. Волатильность обладает вирусоподобными свойствами. Это началось как сфера деятельности небольшой группы специалистов-квантов.И он распространился, чтобы заразить всех ». Он отмечает, что слишком многие люди используют волатильность как меру риска, но реальный риск — это безвозвратная потеря капитала. Сосредоточение внимания на краткосрочной волатильности может привести к стадному поведению инвесторов, создавая риск внезапной распродажи.

Еще одна область, которая может подвергнуться стрессу, — это рынок корпоративных облигаций. По данным Moody’s, доходность американских спекулятивных (или мусорных) облигаций 9 февраля достигла 6,44%, что является самым высоким показателем с декабря 2016 года.Стоимость крупнейшего биржевого фонда бросовых облигаций резко упала (см. Диаграмму). Если мировая экономика продолжит укрепляться, компании смогут выплачивать свои проценты. Moody’s считает, что к началу следующего года уровень дефолта по бросовым облигациям снизится с 3,2% до 2%.

Но рынок изменился после кризиса 2007-08 гг. Снижение банковского кредитования вынудило европейские компании обратиться к рынкам облигаций; Объем выпуска высокодоходных облигаций в 2013-17 годах был в три раза выше, чем в 2008-2012 годах, сообщает компания Ironshield Capital, управляющая фондами.Банки также вкладывают меньше капитала в маркетинг, а это означает, что облигации будет трудно продать быстро. «Корпоративное кредитование может стать следующим кризисом в процессе становления», — предупреждает консалтинговая компания Absolute Strategy Research, вызывая опасения по поводу «потенциальных проблем с ликвидностью, связанных с высокой доходностью».

Третья возможность заключается в том, что рынки могут быть слишком оптимистичны в отношении экономического роста. Индекс менеджеров по закупкам в обрабатывающей промышленности Китая снизился в последние месяцы, а рост кредитования упал до самого низкого уровня за 31 месяц.Джон-Пол Смит из консалтинговой компании Ecstrat обеспокоен тем, что риски для китайской экономики будут усугубляться обострением напряженности в отношениях с Америкой, и что они, вероятно, «станут более заметными в ближайшие недели по широкому кругу областей политики. в дополнение к торговле ». И индекс Bloomberg Commodity, и индекс Baltic Dry (судоходство), индикаторы, чувствительные к мировому спросу, в последние недели снизились.

Конечно, чрезмерный оптимизм в отношении роста будет означать, что центральные банки должны быть менее бдительными в отношении инфляции, и доходность облигаций может снова упасть.Но это не будет хорошей новостью для акций, тем более что аналитики прогнозируют почти 18% рост прибыли в этом году для компаний, входящих в индекс S&P 500, по словам Эндрю Лапторна из французского банка Société Générale. Это оставляет много места для разочарования.

Связанная с этим проблема заключается в том, что американский рынок представляет более половины индекса MSCI World, а это означает, что люди, которые думают, что у них диверсифицированный портфель, на самом деле имеют концентрированную ставку. Как отмечает Марк Тинкер из Axa Investment Managers, последний раз, когда одна страна составляла такую ​​большую часть глобального индекса, была Япония в конце 1980-х годов.Это не сработало.

Некоторые или даже все эти опасения могут никогда не быть реализованы. Но с учетом того, что соотношение цены и прибыли на американском фондовом рынке с поправкой на цикличность примерно вдвое превышает долгосрочное среднее значение, акции уязвимы для любых плохих новостей.

^{Economist.com/blogs/buttonwood}

Эта статья появилась в разделе «Финансы и экономика» печатного издания под заголовком «Список опасений»

Биосенсор на основе FRET для измерения активации Gα13 в отдельных клетках

Abstract

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) обеспечивает способ прямого наблюдения за активацией гетеротримерных G-белков рецепторами, связанными с G-белками (GPCR).С этой целью создаются биосенсоры на основе FRET, в которых используются субъединицы гетеротримерного G-белка, меченные флуоресцентными белками. Эти биосенсоры на основе FRET дополняют существующие косвенные способы наблюдения активации GPCR. Здесь мы сообщаем о вставке mTurquoise2 в несколько сайтов в субъединице Gα13 человека с целью разработки биосенсора активации Gα13 на основе FRET. Было обнаружено, что три флуоресцентно меченных варианта Gα13 являются функциональными на основании i) локализации на плазматической мембране и ii) способности рекрутировать p115-RhoGEF при активации рецептора LPA2.Меченые субъединицы Gα13 использовали в качестве донора FRET и объединяли с cp173Venus, слитой с субъединицей Gγ2, в качестве акцептора. Мы сконструировали биосенсоры Gα13, создав единственную плазмиду, которая продуцирует Gα13-mTurquoise2, Gβ1 и cp173Venus-Gγ2. Биосенсоры активации Gα13 показали быстрый и устойчивый ответ при использовании в первичных эндотелиальных клетках человека, подвергшихся действию тромбина, запускающих рецепторы, активируемые эндогенными протеазами (PAR). Этот ответ эффективно подавлялся RGS-доменом p115-RhoGEF, и из данных биосенсора мы сделали вывод, что это связано с активностью GAP.Наконец, мы продемонстрировали, что датчик Gα13 может использоваться для анализа эффективности связывания гетеротримерного G-белка в отдельных живых клетках. Мы пришли к выводу, что биосенсор Gα13 является ценным инструментом для измерения живых клеток, который исследует пространственно-временные аспекты активации Gα13.

Образец цитирования: Mastop M, Reinhard NR, Zuconelli CR, Terwey F, Gadella TWJ Jr, van Unen J, et al. (2018) Биосенсор на основе FRET для измерения активации Gα13 в отдельных клетках. PLoS ONE 13 (3): e0193705.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705

Редактор: Sabato D’Auria, Consiglio Nazionale delle Ricerche, ИТАЛИЯ

Поступила: 29 ноября 2017 г .; Одобрена: 19 февраля 2018 г .; Опубликован: 5 марта 2018 г.

Авторские права: © 2018 Mastop et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Плазмиды и информацию о плазмидах можно получить на сайте addgene (http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/). Большинство экспериментальных данных представлено в рукописи, а исходные данные депонированы: https://doi.org/10.5281/zenodo.1158456.

Финансирование: JG было поддержано грантом NWO Chemical Sciences ECHO (711.013.009). MJWA получило финансовую поддержку от бразильского агентства по финансированию исследований CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior) (грант: BEX 13247 / 13-1).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), являются членами большого семейства рецепторов, расположенных на мембране, с примерно 750 генами, кодирующими GPCR, идентифицированными в геноме человека [1]. Эти семь трансмембранных белков могут воспринимать широкий спектр сигналов, включая свет, гормоны, ионы и нейротрансмиттеры [2].GPCR действуют как факторы обмена гуанина (GEF) [3] для гетеротримерных G-белков. Эти белковые комплексы состоят из субъединиц Gα, Gβ и Gγ. Гетеротример представляет собой белковый комплекс периферической мембраны за счет липидной модификации субъединиц Gα и Gγ [4].

Активность GEF проявляется в субъединице Gα, которая может быть преобразована из неактивного состояния, связанного с GDP, в активное состояние, связанное с GTP [5]. Активация комплекса приводит к конформационным изменениям и в некоторых случаях к диссоциации субъединицы Gα от димера Gβγ [2,6,7].Как активированная GTP-связанная субъединица Gα, так и димер Gβγ способны активировать нижестоящие эффекторы [2].

Можно различить почти двадцать различных субъединиц Gα, которые сгруппированы в четыре класса; Gi / o, Gs, Gq и G12 / 13 [2]. В этой рукописи мы будем использовать Gα13 для обозначения субъединицы и G13 для обозначения гетеротримеров, состоящих из Gα13, Gβ и Gγ, та же терминология будет использоваться для Gq / Gαq и Gi / Gαi, соответственно. Каждый класс субъединиц Gα активирует различные нижестоящие эффекторы [5].Лучше всего охарактеризованными эффекторами субъединиц Gα12 / Gα13 являются RhoGEF, которые активируют RhoA, например LARG, PDZ-RhoGEF и p115-RhoGEF [8,9]. В течение некоторого времени считалось, что активация GPCR субъединиц Gα12 / Gα13 является преобладающим способом активации RhoA. Эта точка зрения изменилась за последнее десятилетие с идентификацией RhoGEFs, которые могут активироваться Gαq [9,10]. В настоящее время ясно, что и Gαq, и Gα12 / Gα13 могут быстро активировать передачу сигналов RhoA в клетках [11,12], хотя и путем активации различных эффекторов.Поскольку класс Gq и класс G12 / 13 эффективно активируют RhoA, было трудно различить, какой из этих двух гетеротримерных комплексов G-белок активируется, когда измеряются только нижестоящие эффекты. Еще больше усложняет ситуацию то, что GPCRs, которые активируют G12 / 13, часто также активируют Gq [13,14]. Тем не менее, ясно, что передача сигналов через Gq или G12 / 13 имеет разные физиологические эффекты [13,15,16]. Следовательно, необходимы инструменты, которые могут измерить активацию самого гетеротримерного G-белка.

Прямое наблюдение активации гетеротримерного G-белка обычно проводят путем количественной оценки связывания радиоактивно меченных нуклеотидов [17]. Этот подход трудоемок, использует поврежденные клетки и не имеет временного разрешения. Более того, этот метод обычно менее подходит для Gq, Gs и G12 / 13 из-за их низкого уровня экспрессии по сравнению с Gi [18]. С другой стороны, оптические считывания, часто основанные на методах FRET и биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET), хорошо подходят для измерения активности передачи сигналов с высоким временным разрешением в интактных клетках [19,20].Несколько групп создали биосенсоры на основе BRET или FRET для обнаружения событий непосредственно после активированных GPCR [20–24]. Оптические биосенсоры, основанные на гетеротримерных G-белках, особенно подходят для регистрации активации GPCR [25]. Однако сообщалось только о нескольких оптических биосенсорах, сообщающих об активации Gα12 или Gα13.

Sauliere et al. сообщили о биосенсоре на основе BRET для обнаружения активации активации Gα13, что позволяет обнаруживать предвзятый агонизм через рецептор ангиотензина II типа 1 (AT1R) [26].Однако этому подходу не хватает пространственного разрешения. Улучшенные люциферазы, такие как нанолюцифераза, позволили проводить измерения BRET отдельных клеток, но требуется более длительное время сбора данных, поэтому временное разрешение уменьшается [27]. Как правило, датчики на основе FRET имеют более высокую интенсивность излучения, что требует более короткого времени сбора данных для получения достаточного пространственного и временного разрешения. Таким образом, разработка основанного на FRET биосенсора, сообщающего об активации Gα13, будет реальным преимуществом для исследований передачи сигналов GPCR.Ранее мы сообщали об одинарных плазмидных системах, которые обеспечивают экспрессию мультимерного сенсора на основе FRET для Gαq и Gαi [28,29]. Здесь мы сообщаем о разработке, характеристике и применении единственной плазмиды, биосенсора на основе FRET для активации Gα13.

Результаты

Стратегия мечения Gα13 флуоресцентным белком

Чтобы напрямую измерить активацию Gα13 с высоким пространственно-временным разрешением в живых клетках, мы стремились создать функциональную, меченную флуоресцентным белком (FP) субъединицу Gα13.Субъединицы Gα не могут быть помечены на N- или C-конце, так как они необходимы для взаимодействия с субъединицей Gβγ и GPCR [30]. Чтобы функционально пометить Gα13, FP должен быть вставлен в последовательность Gα13, как это было ранее сделано для других изоформ Gα [25,31].

Первоначально мы использовали выравнивание последовательностей четырех классов Gα-белков и идентифицировали остатки Gαq [32] и Gαi [29], после которых мы ранее вставили mTurquoise2 (Рис. 1B, S1 Рис). Основываясь на гомологии последовательностей, мы выбрали вставку mTurquoise2 после остатка Q144 человеческого Gα13, обозначенного черным прямоугольником в выравнивании.При трансфекции плазмиды, кодирующей этот вариант, мы наблюдали цитоплазматическую флуоресценцию. Эта локализация, вероятно, отражает неправильную укладку или нацеливание субъединицы Gα, поскольку хорошо уложенные и функционально меченые варианты локализуются на плазматической мембране [31,32]. Изучение кристаллической структуры (PDB ID: 1ZCB) показало, что Q144 является частью α-спирали (αB2), которая, вероятно, будет разрушена после модификации или вставки [33].

Рис. 1. Вставка флуоресцентного белка в различные положения в Gα13.

(A) Белковая структура человеческого Gα13 (PDB ID: 1ZCB). Выделенные остатки указывают на аминокислоту, предшествующую вставленному флуоресцентному белку. Успешные сайты для вставки mTurquoise2-Δ9 в Gα13 розовым цветом и неудачные сайты оранжевым. (B) Частичное выравнивание последовательности белка (полное выравнивание см. S1 фиг.) Различных классов Gα. Выделенные остатки указывают на аминокислоту, предшествующую вставленному флуоресцентному белку (или люциферазе). Жирным шрифтом выделены сайты, которые ранее использовались для вставки Rluc [26].Вставка mTurquoise2-Δ9 в Gα13 после остатка Q144 (черный) была основана на гомологии с предыдущими вставками в Gαq и Gαi (черный). Удачные сайты для вставки mTurquoise2-Δ9 (R128, A129 и R140) в розовый и неудачные сайты (L106 и L143) в оранжевый. Цифры, указанные под выравниванием, соответствуют номерам вариантов Gα13, используемым во всей рукописи. Цвета под выравниванием совпадают с цветами αHelices, показанных на (A). (C) Конфокальные изображения меченых вариантов Gα13, временно экспрессируемых в клетках HeLa.Цифры в левом нижнем углу каждого изображения указывают количество клеток, которые показали локализацию плазматической мембраны из общего числа проанализированных клеток. Меченые варианты Gα13 также локализуются в структурах внутри клетки, которые предположительно являются эндомембранами. Ширина изображений 76 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g001

Затем мы использовали структуру белка, чтобы выбрать ряд остатков, которые были рядом с предыдущими сайтами вставки и рядом или рядом с концом α- спираль (αA, αB2 или αB1).Мы также взяли с собой сайт вставки (L106), который ранее использовался для вставки люциферазы в Gα13 [26]. Мы использовали усеченный mTurquoise2, удалив последние 9 аминокислот, так как это хорошо работало в сенсоре Gi [29]. Сайты вставки выделены на структуре белка и в выравнивании последовательностей на фиг. 1A и 1B. Различные варианты пронумерованы как Gα13.1, Gα13.2, Gα13.3, Gα13.5 и Gα13.6 по всей рукописи.

Плазмиды, кодирующие различные варианты с метками, трансфицировали в клетки HeLa, и мы наблюдали поразительные различия в локализации.Как показано на фиг. 1C, варианты 1 и 6 показали цитоплазматическую локализацию. Напротив, сильное мечение плазматической мембраны наблюдалось для вариантов Gα13.2, Gα13.3 и, в меньшей степени, для Gα13.5. Поскольку ожидается, что нативный Gα13 будет локализоваться на плазматической мембране за счет пальмитоилирования [4], мы решили продолжить оптимизацию и характеристику вариантов 2, 3 и 5.

Функциональность помеченных вариантов Gα13

Правильная локализация меченых вариантов Gα13 не обязательно отражает функциональность в отношении активности в передаче сигналов, т.е.е. возможность обмена ВВП на GTP. Чтобы определить функциональность, мы обратились к динамическому клеточному анализу. Этот анализ основан на наблюдении, что эктопическая экспрессия Gα13 необходима для перемещения p115-RhoGEF на плазматическую мембрану после стимуляции GPCR [34]. Чтобы оценить функциональность Gα13, мы совместно экспрессировали рецептор LPA2-P2A-mCherry [22], p115-RhoGEF, помеченный SYFP1, и различные варианты Gα13, включая немеченый нативный вариант (фиг. 2, S2, фиг.). Клетки, в которых Gα13 не был чрезмерно экспрессирован, не демонстрировали перемещения p115-RhoGEF после активации GPCR (фиг. 2B и 2C).Однако в присутствии нативного Gα13 было замечено перемещение p115-RhoGEF (рис. 2B и 2C). Эти данные согласуются с предыдущими данными и показывают, что функциональный Gα13 необходим для рекрутирования p115-RhoGEF на плазматическую мембрану. Затем аналогичные эксперименты были выполнены в присутствии Gα13 вариантов 2, 3 и 5, помеченных mTurquoise2Δ9. Во всех трех случаях наблюдалось устойчивое перемещение p115-RhoGEF (рис. 2). Напротив, перемещение не было очевидным, когда использовался вариант Gα13 (вариант 1), который не показал эффективной локализации на плазматической мембране (рис. 2B и 2C).Следовательно, мы наблюдали корреляцию между локализацией мембраны и функциональностью в анализе набора. В целом, результаты подтверждают мнение о том, что меченые варианты 2, 3 и 5 Gα13 могут быть активированы с помощью GPCR и способны рекрутировать p115-RhoGEF.

Рис. 2. Способность меченых вариантов Gα13 рекрутировать p115-RhoGEF.

(A) Конфокальные изображения репрезентативной клетки HeLa, экспрессирующей SYFP1-p115-RhoGEF, Gα13.2-mTurquoise2-Δ9 и LPA2-P2A-mCherry (здесь показан только SYFP1-p115-RhoGEF, для локализации других конструкций см. S2 рис.) (до (t = 0 с) и после (t = 100 с) добавления 3 мкМ LPA).Ширина картинок 67 мкм. (B) Средняя интенсивность цитоплазматической флуоресценции SYFP1-p115-RhoGEF с течением времени. Через 8 с добавляли 3 мкМ LPA. Все клетки временно экспрессировали рецептор LPA2-P2A-mCherry. Число отображаемых клеток: p115-RhoGEF n = 5, Gα13 немаркированный + p115-RhoGEF n = 15, Gα13.1 + p115-RhoGEF n = 27, Gα13.2 + p115-RhoGEF n = 28, Gα13,3 + p115-RhoGEF n = 24, Gα13,5 + p115-RhoGEF n = 20. Данные были получены из трех независимых экспериментов.(C) Количественная оценка интенсивности флуоресценции при t = 50 с для каждого варианта Gα13 относительно t = 0 с. Точки обозначают отдельные ячейки, а полосы ошибок показывают доверительные интервалы 95%. Количество проанализированных клеток такое же, как в (B).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g002

Оценка меченых вариантов Gα13 для измерения активации Gα13

Сконструировав несколько правильно локализующихся вариантов Gα13, способных рекрутировать p115-RhoGEF, мы исследовали, могут ли эти варианты использоваться для сообщения об активации G13.Используя подход на основе FRET (как описано для Gq [32]), мы отслеживали взаимодействие между различными сгенерированными конструкциями Gα13, меченными mTurquoise2, и димером Gβγ, состоящим из немеченых-Gβ и 173cpVenus-Gγ, на отдельных плазмидах. Эти конструкции позволяют измерять соотношение FRET акцептор (173cpVenus) –донор (mTurquoise2), где активация G13 приводит к изменению расстояния и / или ориентации между парой FRET, тем самым вызывая уменьшение отношения FRET.

Здесь мы совместно экспрессировали немеченый LPA2-рецептор с одним из трех меченых вариантов Gα13, немаркированным Gβ и меченным Gγ.После активации рецептора LPA2 изменение соотношения FRET наблюдалось для всех трех выбранных вариантов Gα13 (рис. 3А). Вариант Gα13.2 показал наибольшее изменение отношения FRET, а вариант Gα13.5 — самое низкое (рис. 3A). Некоторые клетки, экспрессирующие вариант Gα13.3, показали более медленный ответ (рис. 3А).

Рис. 3. Способность меченых вариантов Gα13 сообщать о динамической активации Gα13 с помощью ратиометрической визуализации FRET.

(A) Ратиометрические следы FRET клеток HeLa, экспрессирующих рецептор LPA2 (без тегов), Gβ (без тегов), один из вариантов Gα13 (как указано в заголовке графиков), помеченных mTurquoise2-Δ9, и Gγ, помеченных cp173Venus.Серые линии представляют отдельные ячейки, а черный график представляет собой среднее значение, столбцы ошибок которого указывают доверительные интервалы 95%. LPA добавляли при t = 42-50 с, на что указывает стрелка. Количество проанализированных клеток составляет: Gα13,2-mTurquoise2-Δ9 n = 20, Gα13,3-mTurquoise2-Δ9 n = 16 и Gα13,5-mTurquoise2-Δ9 n = 11. Данные панели А приобретаются за несколько дней. (B) Ратиометрические следы FRET клеток HeLa, экспрессирующих рецептор LPA2 (без тегов), Gα13.2-mTurquoise2-Δ9 и либо Gγ, помеченный cp173Venus ( n = 38) (и немаркированный Gβ), либо Gβ, меченный mVenus ( n = 25) (и немаркированный Gγ). LPA добавляли при t = 50 с, на что указывает стрелка. Данные из панели B собираются в тот же день.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g003

Недавно было сообщено о датчике FRET для Gα13, в котором использовались меченые Gα и субъединицы Gβ [35]. Таким образом, мы также исследовали, приводит ли маркировка субъединицы Gβ вместо субъединицы Gγ к более высокому изменению соотношения FRET для наиболее эффективного варианта Gα13.Из рис. 3B можно сделать вывод, что мечение субъединицы Gγ с помощью акцептора FRET приводит к наибольшему изменению соотношения FRET при активации Gα13 через рецептор LPA2, что согласуется с нашими предыдущими наблюдениями [32].

Создание и характеристика биосенсоров FRET для активности Gα13

Ранее мы показали для активационных биосенсоров Gαq [28] и Gαi [29], что одна плазмида экспрессии обеспечивает надежную коэкспрессию компонентов сенсора и упрощает трансфекцию.Поскольку все три меченых варианта Gα13 способны сообщать об активации Gα13 с использованием 173cpVenus-Gγ в качестве акцептора FRET, мы разработали одиночные плазмидные сенсоры с использованием каждого из вариантов Gα13. Фиг. 4A показывает схематический обзор конструкции плазмиды для сенсора Gα13. Анализ интенсивностей CFP и YFP из отдельных клеток показывает лучшую корреляцию для одной плазмидной системы по сравнению с клетками, трансфицированными отдельными плазмидами (рис. 4B).

Рис. 4. Разработка и характеристика биосенсоров активации Gα13 на основе FRET.

(A) Архитектура конструкции биосенсора Gα13, кодирующей Gβ-2A-cp173Venus-Gγ ₂ -IRES-Gα13-mTurquoise2-Δ9, под контролем промотора CMV. (B) Эмиссию CFP и YFP измеряли из отдельных клеток, экспрессирующих сенсор Gα13.2 из одной плазмиды, или из клеток, трансфицированных отдельными плазмидами, кодирующими Gα13.2 и cp173Venus-Gγ ₂ . R ² — коэффициент корреляции. (C) Конфокальные изображения, показывающие локализацию Gα13 в вариантах сенсора (верхний, голубой) и cp173Venus-Gγ ₂ (нижний, желтый) в клетках HeLa (для Gα13.2 расположение датчика в Hek293T и HUVEC см. S3 рис.). Ширина изображений 75 мкм. (D) Следы соотношения FRET для HUVEC, экспрессирующих различные биосенсоры Gα13, стимулированных тромбином при t = 100 с (пунктирные линии обозначают 95% доверительный интервал). Соответствующие кривые YFP ​​и CFP см. На рис. S4. Количество проанализированных клеток составляет: датчик Gα13.2 n = 16, датчик Gα13.3 n = 11, датчик Gα13.5 n = 16.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g004

Как можно заключить из фиг. 4C, субклеточная локализация различных сенсоров Gα13, экспрессируемых в клетках HeLa, сходна.Как опубликовано, варианты Gα13 в основном расположены на плазматической мембране, а Gγ — на плазматической мембране и эндомембранах [28]. В клетках Hek293T, однако, временная экспрессия сенсора Gα13.2 приводит к очень круглым клеткам, которые легко отделяются (S3 Рис.), Что позволяет предположить, что очень высокая временная экспрессия сенсора может привести к усилению базальной активности Gα13.

Затем мы оценили работу датчиков в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Известно, что HUVEC реагируют на тромбин, активируя эндогенные рецепторы, активируемые протеазой (PAR), что приводит к передаче сигналов Gα13-RhoA [11,36].Мы не наблюдали эффекта эктопической сенсорной экспрессии в HUVEC. Когда к HUVEC добавляли тромбин, датчик Gα13.2 показал наиболее выраженное изменение FRET (рис. 4D). Это согласуется с ранее описанными четко определенными изменениями FRET сенсора Gx13.2 после стимуляции S1P в HUVECs [11]. Основываясь на данных визуализации соотношения FRET в HUVEC и HeLa, мы выбрали датчик Gα13.2 в качестве предпочтительного биосенсора активации Gα13 из-за его высокой чувствительности и надежного изменения соотношения FRET при активации Gα13.

Характеристика ингибирования Gα13 белком, активирующим ГТФазу

По нашим данным, Gα13.2 достаточно чувствителен для обнаружения передачи сигналов G13, активируемых эндогенными рецепторами тромбина в HUVEC. Мы и другие [11,37,38] использовали домен регулятора передачи сигналов G-белка (RGS) p115-RhoGEF в качестве ингибитора передачи сигналов G13. Домен RGS проявляет активность GTPase Activating Protein (GAP) [39]. Однако неясно, происходит ли ингибирование RGS-доменом в клетках из-за активности GAP или из-за конкурентного связывания RGS-домена и последующих эффекторов с Gα13. В последнем случае можно ожидать изменения соотношения FRET при наличии домена RGS.Чтобы понять механизм действия, мы использовали сенсор Gα13.2 и ко-экспрессировали связанный с мембраной RGS (Lck-mCherry-p115-RGS), который, как показано, эффективно ингибирует активацию RhoA [11].

В присутствии домена RGS мы не наблюдали изменения соотношения FRET сенсора Gα13.2 после добавления тромбина к HUVEC (рис. 5A и 5B и S1 Movie). В контрольном образце (Lck-mCherry) мы действительно наблюдали изменение соотношения сенсора Gα13.2, вызванное тромбином (рис. 5A и 5B и S2 Movie), в то время как соотношения FRET в состоянии покоя были одинаковыми для обоих условий.Отсутствие ответа FRET в присутствии домена RGS, отражающее подавление активного GTP-связанного Gα13, свидетельствует о том, что активность GAP участвует в ингибирующем эффекте домена RGS. Кроме того, мы изучили индуцированное тромбином сокращение HUVEC и показали, что чрезмерная экспрессия домена RGS предотвращает сокращение клеток, даже приводя к общему увеличению площади клеток (рис. 5C и S3 Movie). Вместе эти данные показывают, что домен RGS ингибирует активацию Gα13 и, как следствие, активацию RhoA, которая эффективно блокирует сокращение клеток.

Рис. 5. Влияние домена p115-RhoGEF RGS на активность Gα13.2 и морфологию клеток.

(A) Нормализованные ратиометрические кривые (верхние графики) и соответствующие кривые YFP ​​и CFP (нижние графики) (пунктирные линии показывают 95% доверительный интервал) HUVEC, которые были трансфицированы либо датчиком Gα13.2 FRET, либо Lck-mCherry (контроль, n = 11) или датчик Gα13.2 FRET и Lck-mCherry-RGS (+ RGS, n = 13). Клетки стимулировали при t = 110 с. (B) Ратиометрические изображения репрезентативных клеток, измеренные в (A).Холодные цвета представляют низкие отношения YFP / CFP, соответствующие отношениям эмиссии (ER) справа. (C) Изменение площади ячеек, измеренное в (B), визуализированное в соответствии с панелью LUT справа. Точечные диаграммы справа представляют отдельные измерения (± 95% ДИ) соответствующих клеток, измеренные в (A). Ширина изображения = 54 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g005

Применение биосенсора Gα13.2 в анализах активации GPCR

Опубликованные данные о сцеплении GPCRs с Gα13 часто основаны на косвенных измерениях, и поскольку нижестоящие сигнальные эффекты перекрываются с нижележащими сигнальными эффектами Gq, трудно сделать твердые выводы об участии любой из субъединиц [14].Наш новый датчик FRET позволяет напрямую наблюдать активацию Gα13. Поэтому мы оценили ответы Gαq и Gα13 на стимуляцию выбранных GPCR, опубликованных как сцепление с Gα13 [26,34,40,41]. Эти эксперименты проводили на клетках HeLa, временно экспрессирующих соответствующий GPCR. В качестве контроля стимулировались клетки, экспрессирующие только сенсор Gα13 или Gαq, что не вызывало заметного сенсорного ответа (рис. 6А). При стимуляции рецептора LPA2 (LPA2R) активируются как Gαq, так и Gα13, что соответствует опубликованным данным.Следует отметить, что ряд клеток (47 из 60 для Gαq и 23 из 37 для Gα13), временно экспрессирующих рецептор LPA2, не смогли показать ответ Gα13 или Gαq (рис. 6B). При стимуляции рецептора ангиотензина II типа 1 (AT1R) наблюдается заметный ответ датчика Gαq по сравнению с минимальным ответом датчика Gα13, который аналогичен контролю (сравните фиг. 6C и 6A). Рецептор кисспептина (KissR или GPR54) показал четкую реакцию сенсора Gαq и отсутствие ответа сенсора Gα13 при стимуляции (фиг. 6D).Вместе эти результаты указывают на то, что LPA2R связывается как с Gαq, так и с Gα13, тогда как AT1R и KissR связаны с Gαq и почти не связаны с Gα13. Более того, это показывает, что наш новый датчик Gα13 действительно может быть использован для различения Gα13- и Gαq-связанной передачи сигналов GPCR.

Рис. 6. Прямое наблюдение активации Gα13 и Gαq разными GPCR.

Нормализованные соотношения-метрические следы FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gq (серая линия) или датчиком G13.2 (черная линия) (пунктирные линии обозначают 95% доверительный интервал).(A) В качестве контроля измеряли клетки, экспрессирующие только датчик Gq ( n = 37) или G13.2 ( n = 20). Агонисты добавляли последовательно через 50, 150 и 230 секунд визуализации. (B) Соотношение следов клеток, трансфицированных немеченым рецептором LPA2 рядом с Gαq ( n = 13 (из 60 всего)) или Gα13.2 ( n = 14 (из 37 всего)) , стимулированный при t = 50 с. (C) Соотношение следов клеток, трансфицированных рецептором ангиотензина II типа 1-P2A-mCherry, рядом с Gαq ( n = 22) или Gα13.2 ( n = 9) датчик, стимулированный при t = 50 с. (D) Соотношение следов клеток, трансфицированных немаркированным рецептором поцелуя рядом с сенсором Gαq ( n = 13) или Gα13.2 ( n = 30), стимулированных при t = 50 с (указано стрелкой) .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g006

Обсуждение

Комбинированная активация различных классов гетеротримерных G-белков с помощью GPCR определяет, какие сигнальные сети будут активированы.Известно, что для одного из классов G-белков, G12 / 13, его активация была чрезвычайно сложной. Здесь мы сообщаем о разработке, характеристике и применении биосенсора на основе FRET для активации Gα13. Этот новый инструмент можно использовать для изучения активации Gα13 GPCR в отдельных живых клетках. Кроме того, мы показываем, что датчик G13 достаточно чувствителен, чтобы сообщать об активации эндогенного рецептора в первичных клетках человека (HUVEC).

До сих пор инструменты, доступные для изучения активации Gα13 в отдельных живых клетках, были ограничены.Стратегии на основе BRET использовались для изучения активации класса G12. С этой целью люцифераза Renilla reniformis (Rluc) была вставлена ​​в Gα13 после остатка Ile 108 [42] или Leu 106 [26]. Однако мы обнаружили, что вставка mTurquoise2 после остатка Leu 106 (Gα13.1) не приводит к функционально маркированной субъединице, возможно потому, что Leu106 является частью α-спирали.

Три из пяти оцененных сайтов инсерции mTurquoise2 привели к локализации на плазматической мембране, помеченному Gα13, который был способен рекрутировать p115-RhoGEF на плазматическую мембрану.Локализованный в цитоплазме, меченый вариант Gα13.1 не был способен рекрутировать p115-RhoGEF, что указывает на то, что локализация на плазматической мембране необходима для функционирования. Поскольку все функциональные варианты Gα13 могут сообщать об активации G13, как определено с помощью визуализации соотношения FRET, мы разработали одиночные плазмидные сенсоры для этих трех вариантов. В клетках HeLa локализация, как и ожидалось, Gα13 на плазматической мембране и Gγ на плазматической мембране и эндомембранах. Биосенсоры активации Gα13 экспрессировались в HUVEC и могли сообщать об активации G13 через эндогенные рецепторы, активируемые протеазой (PAR).Сенсор Gα13.2 является наиболее эффективным биосенсором Gα13, исходя из его чувствительности и величины изменения соотношения FRET при активации. Дальнейшее улучшение датчиков может быть достигнуто путем изменения пар FRET [43] или изменения их относительной ориентации путем круговой перестановки [44].

Пока наша рукопись находилась в стадии подготовки, сообщалось о другом варианте Gα13, меченном mTurquoise2 [35]. В этом исследовании флуоресцентный белок был вставлен после остатка 127 Gα13, что очень похоже на наш Gα13.2 вариант, и он показал локализацию плазматической мембраны. Более того, Bodmann et al. наблюдали изменение FRET, когда вариант Gα13, меченный YFP, использовался в комбинации с субъединицей Gβ, меченной CFP, для сообщения об активации рецептора тромбоксана A2 [35]. Независимое наблюдение изменения FRET с использованием аналогичного помеченного варианта Gα13 подтверждает наше мнение о том, что биосенсор на основе G13.2 FRET является ценным инструментом для изучения активации Gα13.

Преимущество нашего датчика FRET заключается в том, что обнаруживается более сильное изменение соотношения, чем для датчика, о котором сообщают Bodmann et al.2017. Хотя они обнаружили максимальное изменение коэффициента FRET на 10%, мы смогли достичь изменения коэффициента FRET до 25% (рис. 3). Это может быть связано с использованием меченого Gβ вместо субъединицы Gγ, поскольку мы также наблюдаем более низкое изменение отношения FRET при использовании меченого Gβ (Рис. 3B). Примечательно, что Bodmann et al. обнаруживают увеличение FRET при стимуляции Gα13 (увеличение YFP, снижение интенсивности CFP), тогда как мы обнаруживаем снижение FRET при стимуляции Gα13 (рис. 3B). Все описанные нами сенсоры G-белка (Gαq, Gαi1,2,3 и Gα13) показывают снижение FRET при активации во всех испытанных до сих пор условиях [11,29,32], что соответствует диссоциации субъединиц Gα и Gβγ. .Более того, субъединицы Gα13, помеченные в разных сайтах (Gα13.2, Gα13.3 и Gα13.5), все демонстрируют снижение FRET (рис. 3). Одно заметное отличие состоит в том, что мы используем донора, помеченного Gα13, и Bodmann et al. используйте акцептор (YFP) с меткой Gα13. Однако неясно, как эта разница может приводить к противоположным изменениям FRET при активации, и поэтому у нас нет твердого объяснения различий в изменении FRET, наблюдаемых Bodmann et al. [35] и в этом исследовании.

Преимущество сконструированного нами сенсора состоит в том, что он позволяет одновременно продуцировать три белка, составляющих гетеротример, из одной плазмиды, и что донор и акцептор присутствуют с четко определенной стехиометрией [28].Это очевидно из лучшей корреляции между интенсивностями эмиссии CFP и YFP по сравнению с трансфекцией отдельных плазмид (рис. 4B). Более того, единая плазмидная система упрощает распространение и применение сенсора. Особенно в первичных клетках, таких как HUVEC, более сложно получить одновременную экспрессию белка из нескольких плазмид, тогда как временная экспрессия единственной сенсорной плазмиды в HUVEC была эффективной.

RGS-домен p115-RhoGEF эффективно ингибирует опосредованную GPCR-Gα12 / 13 активацию RhoA в эндотелиальных клетках [11] и сокращение клеток, как показано на фиг. 5C.В этих условиях датчик Gα13.2 не показывал изменения отношения FRET, что свидетельствует об отсутствии активации. Отсутствие изменения FRET согласуется с идеей, что активность GAP домена RGS отключает активность Gα13 [39].

Применяя сенсор Gα13.2 в клетках HeLa, мы показали, что и Gα13, и Gαq активируются через рецептор LPA2. Напротив, рецептор Kiss и рецептор AT1 вызывали преимущественно сенсорный ответ G? Q. Из наших данных невозможно судить, является ли минорный ответ Gα13 на активацию рецептора AT1 биологически значимым.GPCR, проанализированные в этом исследовании, сообщались как связанные с Gα13 и / или Gαq в других исследованиях [26,34,40,41]. Следует отметить, что временная экспрессия рецептора LPA2 показывает несколько нереагирующих с точки зрения активности Gαq или Gα13. Это можно объяснить недостаточным уровнем рецептора для достижения детектируемой активации.

Поразительно, но рецептор Kiss не активировал биосенсор Gα13, указывая на то, что неспецифическое беспорядочное связывание GPCR с эктопически экспрессируемым биосенсором G-белка не обнаружено.Напротив, мы ранее наблюдали, что HUVEC, обработанные S1P, действительно показывают активацию Gα13, но не активацию Gαq [11]. Вместе эти наблюдения предполагают, что наш набор биосенсоров на основе FRET обеспечивает способ определения селективности связывания GPCR по отношению к гетеротримерным G-белкам в живых клетках. Было бы целесообразно дополнить такие исследования дополнительными считываниями, чтобы проверить возможное возмущение эктопически экспрессируемых сенсоров G-белка.

Таким образом, результаты, полученные в этом исследовании, указывают на то, что Gα13.Биосенсор 2 представляет собой чувствительный датчик активации Gα13 для визуализации живых клеток, который подходит для применения в первичных клетках и способен обнаруживать эндогенную активацию GPCR.

Материалы и методы

Клонирование / конструирование плазмиды

mTurquoise2-Δ9 было вставлено в последовательность Gα13 с использованием ранее описанной стратегии [29]. ПЦР выполняли с последовательностью mTurquoise2, чтобы усечь ее и фланкировать сайтами AgeI с использованием праймеров Fw 5’-ATACCGGTTCTATGGTGAGCAAGGGCG-3 ’и Rv 5’-TAACCGGTGATCCCGGCGGC -3’.Чтобы определить, в какие позиции мы хотели вставить mTurquoise2 в Gα13, мы использовали Pymol, чтобы посмотреть на структуру Gα13, и мы использовали ClustalW для выравнивания нескольких классов Gα. ПЦР с полным вектором была проведена на векторе pcDNA, кодирующем Gα13 человека (заказанном на cDNA.org), чтобы ввести сайт рестрикции AgeI в то место, где мы хотели вставить mTurquoise2, с использованием праймеров Fw 5′-ATACCGGTCATATTCCCTGGGGAGACAAC-3 ‘и Rv 5 ‘- ATACCGGTAAGCTTCTCTCGAGCATCAAC-3′ для Gα13.1, праймеры Fw 5’-ATACCGGTGCCCCCATGGCAGCCC-3 ‘и Rv 5′-ATACCGGTCCGGGTATCAAACGACATCATCTTATC-3′ для Gα13.2, праймеры Fw 5’-ATACCGGTCCCATGGCAGCCCAAGG-3 ‘и Rv 5′-ATACCGGTGGCCCGGGTATCAAACGAC-3′ для Gα13.3, праймеры Fw 5’-ATACCGGTGTTTTTCTTAC’AATATCTAGTCCTGT и Rv 5 ‘-GTACTAGGTCCT и 3′ CTACTGATCαCTGT и RVTACTG5 и RVTACTACGTCCT и RVTACG5 и RVTACTACGTCCTCCT и RVTACTACG5 5’-ATCCGGTCAATATCTTCCTGCTATAAGAGCA-3 ‘и Rv 5′-ATACCGGTTAAGAAAACCCTTGTTTCCACC-3’ для Gα13.6. Вектор пкДНК Gα13, включающий сайт AgeI и продукт ПЦР mTq2, разрезали с помощью AgeI и лигировали, в результате чего получали Gα13, меченный mTurquoise2. Следует отметить, что клонирование варианта Gα13.4 со вставкой mTurquoise2-Δ9 после T139 не удалось.

Мы использовали GFP-p115-RhoGEF (любезный подарок Кита Берриджа, UNC, Чапел-Хилл, США) в качестве матрицы для амплификации p115-RhoGEF с праймерами Fw 5′- AACAGATCTCTTGGTACCGAGCTCGGATC-3 ‘и Rv 5’-AGCGTCGACCCA ‘. Продукт ПЦР, фланкированный сайтами рестрикции BglII и SalI, использовали для клонирования p115-RhoGEF в вектор C1 типа clontech, генерируя mVenus-p115-RhoGEF.

Немеченый рецептор LPA2 был заказан на cDNA.org. Для создания конструкции N1 LPA2 рецептор-P2A-mCherry в стиле clontech проводили ПЦР с использованием праймеров Fw 5’-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3 ’и Rv 5’-TATGTCGACTTGGGTGGAGTCATCAGTG-3’.Конструкция N1-P2A-mCherry, описанная ранее [22], и продукт ПЦР рецептора LPA2 переваривали EcoRI и SalI, и лигирование приводило к конструкции рецептор LPA2-P2A-mCherry.

Варианты одиночного плазмидного сенсора G13 были сконструированы, как описано ранее, с помощью ПЦР с перекрывающимся удлинением [29,45]. Первые ПЦР были выполнены на ранее опубликованном датчике Gαq [28] с использованием праймера A Fw 5′-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3 ‘и праймера B Rv 5′-GTCCGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAG-3’ и на вариантах Gα13GATA с меткой mTurquoise2 ‘-3ACGATCATC-FwGATA с тегом mTurquoise2’-ACT ‘и праймер D Rv 5′-ATCAGCGGGTTTAAACG-3’.Вторую ПЦР проводили на смеси обоих продуктов ПЦР с использованием primerA и primerD. Этот второй продукт ПЦР и сенсор Gαq переваривали с помощью SacI и XbaI, и продукт ПЦР лигировали в сенсор, в результате чего получали сенсор одиночной плазмиды G13.

Lck-mCherry-p115-RhoGEF-RGS был сконструирован, как описано ранее [11]. Домен p115-RhoGEF-RGS (аминокислота 1-252) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Fw 5’-GAGATCAGATCTATGGAAGACTTCGCCCGAG-3 ’и Rv 5’-GAGATCGAATTCTTAGTTCCCCATCACCTTTTTC-3’. Продукт ПЦР и вектор C1 Lck-mCherry в стиле clontech переваривали BglII и EcoRI, и лигирование приводило к вектору C1 стиля clontech, кодирующему Lck-mCherry-p115-RhoGEF-RGS.

Немеченый рецептор Kiss был приобретен на сайте www.cDNA.org.

rAT1aR-mVenus был любезным подарком Петера Варнаи (Университет Земмельвейса, Венгрия). Кодирующая последовательность AT1R была вставлена ​​в mCherry-N1 с пептидом P2A для получения AT1R-P2A-mCherry.

Культура клеток и подготовка проб

клеток HeLa (CCL-2, American Tissue Culture Collection; Manassas, VA, USA) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Gibco, каталожный № 61965–059) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, кат. 10270–106), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C в 7% CO ₂ .Для микроскопических экспериментов клетки выращивали на круглых покровных стеклах Ø 24 мм, толщиной 0,13–0,16 мм (Menzel, каталожный № 360208) до 50% слияния и трансфицировали плазмидной ДНК размером 500 нг, 1 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный № 11668–019) или 4,5 мкл PEI (1 мг / мл) в воде (pH 7,3) и 100 мкл OptiMEM (Gibco, каталожный № 31985–047) на чашку Ø 35 мм с покровным стеклом Ø 24 мм. Через день после трансфекции покровное стекло помещали в камеру для клеток (Attofluor, Invitrogen). Среда для микроскопии (20 мМ HEPES (pH = 7,4), 137 мМ NaCL, 5.4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 0,8 мМ MgCl2 и 20 мМ глюкозы) добавляли к покровному стеклу в камере для клеток. Логометрические эксперименты FRET проводили при 37 ° C.

Первичные HUVEC, полученные от Lonza (Verviers, Бельгия), высевали в культуральные колбы, покрытые фибронектином (FN). HUVEC, выращенные в среде EGM-2, дополненные одиночными квотами (Lonza) при 37 ° C в 5% CO ₂ . Для микроскопических экспериментов HUVEC трансфицировали в пассаже № 4 или № 5 с помощью системы трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и набора для трансфекции Neon (Invitrogen) и выращивали на покрытых FN круглых покровных стеклах Ø 24 мм, 0.Толщиной 13–0,16 мм (Menzel, каталожный № 360208). Для трансфекции использовали 2 мкг плазмидной ДНК и генерировали одиночный импульс при 1300 В в течение 30 мс. [11]. Логометрические эксперименты FRET проводили при 37 ° C в среде EGM-2 и в 5% CO ₂ .

Конфокальная микроскопия

Для получения конфокальных изображений живых клеток HeLa, временно экспрессирующих либо меченый вариант Gα13, либо сенсор одиночной плазмиды G13, конфокальный микроскоп Nikon A1, оснащенный масляным иммерсионным объективом 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер точечного отверстия был установлен на 1 единицу Эйри. Для проверки локализации меченых вариантов Gα13 образцы возбуждали лазерной линией 457 нм, использовали дихроичное зеркало 457/514 и излучение фильтровали через фильтр 482 / 35BP. Для проверки локализации сенсорных конструкций одиночной плазмиды G13 образцы возбуждали лазерной линией 440 нм (CFP) и 514 нм (YFP), использовали дихроичное зеркало 457/514 и излучение фильтровали через 482 / 35BP (CFP). ) или 540 / 30BP (YFP) соответственно.Изображения были получены в режиме последовательного строчного сканирования, чтобы избежать проступания.

Анализ набора p115-RhoGEF

Для анализа набора p115-RhoGEF клетки HeLa культивировали в среде RPMI с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и L-глутамина (2 мМ) (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия) и хранили при 7 ° C в 5% -ной среде. CO ₂ атмосфера. Клетки собирали, и 50 000 клеток / лунку высевали на восьми-луночные μ-слайды (Ibidi). Через 24 часа клетки временно трансфицировали 0.25 мкг рецептора LPA2-P2A-mCherry, вариантов SYFP1-p115-RhoGEF и Gα13, меченных mTurquoise2 (Gα13.1, Gα13.2, Gα13.3, Gα13.5). Трансфекцию клеток HeLa проводили с использованием Lipofectamine 3000 и Plus Reagent в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). Через 24 часа после трансфекции ростовую среду заменяли средой без фенолового красного RPMI, и измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов. На протяжении всех измерений клетки хранили при 37 ° C.Клетки стимулировали олеоил-L-α-лизофосфатидовой кислотой (10 мкМ, Sigma) в указанный момент времени. Конфокальные изображения получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Мангейм, Германия), оснащенного водно-иммерсионным объективом HCX PL APO 63 ×, N.A. 1.2. mTurquoise2 возбуждали на длине волны 458 нм, а излучение регистрировалось в диапазоне 465-500 нм; SYFP1 возбуждали на длине волны 514 нм, а эмиссию регистрировали в диапазоне 520-550 нм; mCherry возбуждали на длине волны 561 нм, а эмиссия регистрировалась в диапазоне 600-670 нм.Чтобы избежать проступания, изображения были получены в режиме последовательной строчной развертки. Анализ изображений проводился с Фиджи.

Широкопольная микроскопия

Ратиометрическая визуализация FRET клеток HeLa.

Ратиометрические эксперименты FRET были выполнены на широкопольном флуоресцентном микроскопе (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH) [32], оборудованном ксеноновой дуговой лампой с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK) и программным обеспечением Metamorph 6.1, для 240 с или 288 с (элементы управления на рис. 6A) и с интервалом времени 2 с.Интенсивность флуоресценции донора и акцептора регистрировали при времени экспозиции 200 мс на изображение с использованием объектива с 40-кратным увеличением (иммерсионный Plan-Neoflor 40 × / 1,30; Carl Zeiss GmbH). Использовали клетки HeLa, экспрессирующие cp173Venus-Gγ (или немаркированный Gγ на рис. 3В), немаркированный Gβ (или меченый mVenus Gβ на рис. 3В) и один из меченых mTurquoise2 вариантов Gα13 из нескольких плазмид или экспрессирующие единственный плазмидный Gq-сенсор или один вариантов датчика G13. GPCR экспрессируется из отдельной плазмиды, которая представляет собой немеченый рецептор LPA2, немеченый рецептор Kiss или рецептор ангиотензина II типа 1-P2A-mCherry.Флуорофоры возбуждали светом 420 нм (ширина щели 30 нм), излучение mTq2 регистрировалось фильтром BP470 / 30, излучение YFP ​​регистрировалось фильтром BP535 / 30, а излучение RFP регистрировалось фильтром BP620 / 60 путем поворота фильтра. колесо. Через 50 с клетки HeLa (если не указано иное) стимулировали конечной концентрацией 3 мкМ LPA (Sigma), 100 нМ амида Kiss-1 (112–121) (Phoenix Pharmaceuticals) или 10 мкМ ангиотензина (Sigma). Кривые были нормализованы к средней интенсивности первых 5 записанных кадров.ImageJ использовался для выполнения коррекции фона и расчета средней интенсивности каждой ячейки для каждой временной точки. Клетки, не показавшие видимого ответа, не использовали для анализа. Общее количество отображаемых клеток и количество проанализированных клеток («респонденты») указаны в подписях к рисункам.

Ratiometric FRET imaging HUVECs.

Для проведения ратиометрических FRET-экспериментов на HUVEC мы использовали то же оборудование микроскопии и настройки фильтров, которые использовались для выполнения ратиометрической FRET-визуализации клеток HeLa, однако есть некоторые различия в способах записи данных.Визуализация HUVEC производится в течение 1230 секунд с интервалом времени 10 секунд, и визуализация выполняется при 37 ° C в среде EGM-2 и в 5% CO ₂ . Через 110 секунд HUVEC стимулировали конечной концентрацией тромбина 1 Ед / мл (Haematologic Technologies). Процедура обработки изображений, которая использовалась для отображения изменения площади клеток во время микроскопии живых клеток HUVEC, описана в другом месте [11]). Чтобы показать соотношение FRET на изображениях клеток, использовали imageJ. Сначала мы преобразовали CFP и стек YFP в 32-битный тип и скорректировали фоновый сигнал.Затем стопки были разделены для получения стопки YFP / CFP. Мы использовали стек CFP для создания двоичной маски и умножили эту маску на стек YFP / CFP. Наконец, мы применили плавный фильтр для уменьшения шума и использовали таблицу поиска (LUT) для визуализации изменений в соотношении FRET.

Дополнительная информация

S1 Рис. Полное аминокислотное выравнивание четырех классов человеческих Gα-субъединиц гетеротримерных G-белков.

Обратите внимание, что аминокислотная последовательность Gαs соответствует короткой изоформе.Выделенные остатки указывают на аминокислоту, предшествующую вставленному флуоресцентному белку (или люциферазе). Жирным шрифтом выделены сайты, которые ранее использовались для вставки Rluc (Saulière et al., 2012). Вставка mTurquoise2-Δ9 в Gα13 после остатка Q144 (черный) была основана на гомологии с предыдущими вставками в Gαq и Gαi (черный). Удачные сайты для вставки mTurquoise2-Δ9 (R128, A129 и R140) в розовый и неудачные сайты (L106 и L143) в оранжевый.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.s001

(PNG)

S3 Рис. Изображения клеток Hek293T (слева), полученные с помощью конфокальной микроскопии, или изображения HUVEC, полученные с помощью широкопольной микроскопии, оба экспрессируют датчик G13.2.

Верхние изображения показывают локализацию Gα13.2, а нижние изображения показывают локализацию Gγ. Клетки Hek293T возбуждали светом 457 нм (CFP) и 514 нм (YFP), и, соответственно, для обнаружения испускаемого света использовали 482 / 35BP и 540 / 30BP. Ширина изображений 70 мкм. Клетки HUVEC возбуждали светом 420 нм (CFP) и 490 нм (YFP), и, соответственно, для обнаружения испускаемого света использовали 470 / 30BP и 535 / 30BP.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.s003

(PNG)

S4 Рис. Следы CFP и YFP HUVEC, экспрессирующих различные биосенсоры G13, стимулированных 1 ед. / Мл тромбина при t = 100 с (пунктирные линии обозначают 95% доверительный интервал).

Количество проанализированных ячеек: датчик G13.2 n = 16, датчик G13.3 n = 11, датчик G13.5 n = 16.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.s004

(PNG)

Благодарности

Мы благодарим сотрудников наших лабораторий за их постоянный интерес и поддержку этого проекта.Плазмида с rAT1aR-mVenus была любезным подарком от Питера Варнаи (Университет Земмельвейса, Венгрия), а GFP-p115-RhoGEF предоставлен Кейт Берридж (UNC, Чапел-Хилл, США).

Список литературы

1. 1. Вассилатис Д.К., Хоманн Дж. Г., Зенг Х., Ли Ф., Ранчалис Дж. Э., Мортруд М. Т. и др. Репертуары рецепторов, связанных с G-белками, человека и мыши. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 4903–8. pmid: 12679517
2. 2. Wettschureck N, Offermanns S. G-белки млекопитающих и их специфические для клеточного типа функции.Physiol Rev.2005; 85: 1159–204. pmid: 16183910
3. 3. Ренс-Домиано С., Хамм Х. Структурные и функциональные взаимоотношения гетеротримерных G-белков. FASEB J. 1995; 9: 1059–66. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7649405 pmid: 7649405
4. 4. Wedegaertner PB, Wilson PT, Bourne HR. Липидные модификации тримерных G-белков. J Biol Chem. 1995; 270: 503–6. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7822269 pmid: 7822269
5. 5. Хеплер-младший, Гилман АГ.G белки. Trends Biochem Sci. 1992; 17: 383–7. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1455506 pmid: 1455506
6. 6. Франк М., Тюмер Л., Лозе М. Дж., Бюнеман М. G Активация белка без диссоциации субъединицы зависит от G {альфа} (i) -специфической области. J Biol Chem. 2005; 280: 24584–90. pmid: 15866880
7. 7. Левицки А., Кляйн С. Диссоциация субъединицы G-белка не является неотъемлемой частью действия G-белка. Chembiochem. 2002; 3: 815–8. pmid: 12210980
8. 8.Зилер С. Регулирование белков RhoGEF рецепторами, сопряженными с G12 / 13. Br J Pharmacol. 2009; 158: 41–9. pmid: 19226283
9. 9. Aittaleb M, Богут, Калифорния, Tesmer JJG. Структура и функция факторов обмена генов гуаниновых нуклеотидов, регулируемых гетеротримерным G-белком. Mol Pharmacol. 2010; 77: 111–25. pmid: 19880753
10. 10. Рохас Р.Дж., Йохе М.Э., Гершбург С., Кавано Т., Козаса Т., Сондек Дж. Галфак непосредственно активирует p63RhoGEF и Trio через консервативное расширение гомологичного домена плекстрина, ассоциированного с Dbl.J Biol Chem. 2007. 282: 29201–10. pmid: 17606614
11. 11. Рейнхард Н.Р., Мастоп М., Инь Т., Ву Й., Босма Е.К., Гаделла TWJ и др. Баланс между путями Gα i -Cdc42 / Rac и Gα 12/13 -RhoA определяет регуляцию эндотелиального барьера с помощью сфингозин-1-фосфата. Ван Хаастерт П., редактор. Mol Biol Cell. 2017; mbc.E17-03-0136. pmid: 28954861 ​​
12. 12. ван Унен Дж., Инь Т., Ву И.И., Мастоп М., Гаделла TWJ, Годхарт Дж. Кинетика рекрутирования и аллостерической активации изоформ ARHGEF25 гетеротримерным G-белком Gαq.Научный доклад 2016; 6: 36825. pmid: 27833100
13. 13. Worzfeld T, Wettschureck N, Offermanns S. Передача сигналов, опосредованная G (12) / G (13), в физиологии и болезнях млекопитающих. Trends Pharmacol Sci. 2008; 29: 582–9. pmid: 18814923
14. 14. Riobo NA, Manning DR. Рецепторы, связанные с гетеротримерными G-белками семейства G12. Trends Pharmacol Sci. 2005. 26: 146–54. pmid: 15749160
15. 15. Takefuji M, Wirth A, Lukasova M, Takefuji S, Boettger T., Braun T. и др.G (13) -опосредованный сигнальный путь необходим для сердечного ремоделирования, вызванного перегрузкой давлением, и сердечной недостаточности. Тираж. 2012; 126: 1972–82. pmid: 22972902
16. 16. Wirth A, Benyó Z, Lukasova M, Leutgeb B, Wettschureck N, Gorbey S и др. G12-G13-LARG-опосредованная передача сигналов в гладких мышцах сосудов необходима для индуцированной солью гипертензии. Nat Med. 2008; 14: 64–8. pmid: 18084302
17. 17. Миллиган Г. Принципы: расширение возможностей анализа связывания [35S] GTP gamma S.Trends Pharmacol Sci. 2003. 24: 87–90. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12559773 pmid: 12559773
18. 18. Странный PG. Использование анализа связывания GTPγS ([35S] GTPγS и Eu-GTPγS) для анализа активности лиганда и эффективности в отношении рецепторов, связанных с G-белком. Br J Pharmacol. 2010; 161: 1238–49. pmid: 20662841
19. 19. ван Унен Дж., Вулард Дж., Ринкен А., Хоффманн С., Хилл С.Дж., Годхарт Дж. и др. Перспектива изучения передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белками, с помощью биосенсоров с резонансным переносом энергии в живых организмах.Mol Pharmacol. 2015; 88: 589–95. pmid: 25972446
20. 20. Lohse MJ, Nuber S, Hoffmann C. Методы резонансного переноса энергии флуоресценции / биолюминесценции для изучения активации рецепторов, связанных с G-белками, и передачи сигналов. Pharmacol Rev.2012; 64: 299–336. pmid: 22407612
21. 21. Клистер Т., Мехта С., Чжан Дж. Одноклеточный анализ передачи сигнала G-белка. J Biol Chem. 2015; 290: 6681–8. pmid: 25605723
22. 22. ван Унен Дж., Рашидфаррохи А., Хугендорн Э., Постма М., Гаделла TWJ, Гоэдхарт Дж.Количественный одноклеточный анализ сигнальных путей, активируемых сразу после подтипов гистаминовых рецепторов. Mol Pharmacol. 2016; 90: 162–76. pmid: 27358232
23. 23. Салахпур А., Эспиноза С., Масри Б., Лам В., Барак Л.С., Гайнетдинов Р.Р. Биосенсоры BRET для изучения биологии, фармакологии GPCR и передачи сигналов. Фронт-эндокринол (Лозанна). 2012; 3: 105. pmid: 22952466
24. 24. Hébert TE, Galés C, Rebois RV. Обнаружение и визуализация белок-белковых взаимодействий во время опосредованной G-белком передачи сигнала in vivo и in situ с использованием методов, основанных на флуоресценции.Cell Biochem Biophys. 2006; 45: 85–109. pmid: 16679566
25. 25. Джанетопулос С., Девреотес П. Мониторинг опосредованной рецептором активации гетеротримерных G-белков с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии. Методы. 2002; 27: 366–73. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12217653 pmid: 12217653
26. 26. Saulière A, Bellot M, Paris H, Denis C, Finana F, Hansen JT и др. Расшифровка сложности предвзятого агонизма выявляет новый активный объект рецептора AT1. Nat Chem Biol.2012; 8: 622–30. pmid: 22634635
27. 27. Goyet E, Bouquier N, Ollendorff V, Perroy J. Быстрое и высокое разрешение BRET-визуализации отдельных клеток. Научный доклад 2016; 6: 28231. pmid: 27302735
28. 28. Goedhart J, van Weeren L, Adjobo-Hermans MJW, Elzenaar I., Hink MA, Gadella TWJ Jr. Количественная коэкспрессия белков на уровне отдельной клетки — приложение к мультимерному датчику FRET. PLoS One. 2011; 6: e27321. pmid: 22114669
29. 29. ван Унен Дж., Штумпф А.Д., Шмид Б., Рейнхард Н.Р., Хордийк П.Л., Хоффманн С. и др.Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках. PLoS One. 2016; 11: e0146789. pmid: 26799488
30. 30. Wall MA, Coleman DE, Lee E, Iñiguez-Lluhi JA, Posner BA, Gilman AG и др. Структура гетеротримера G-белка Gi альфа 1 бета 1 гамма 2. Клетка. 1995; 83: 1047–58. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8521505 pmid: 8521505
31. 31. Гибсон СК, Гилман АГ. Субъединицы Gialpha и Gbeta определяют селективность активации G-белка альфа2-адренорецепторами.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103: 212–7. pmid: 16371464
32. 32. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al. Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. BMC Biol. 2011; 9: 32. pmid: 21619590
33. 33. Kreutz B, Yau DM, Nance MR, Tanabe S, Tesmer JJG, Kozasa T. Новый подход к производству функциональных субъединиц G альфа дает активированные и деактивированные структуры белков G альфа (12/13).Биохимия. 2006; 45: 167–74. pmid: 16388592
34. 34. Meyer BH, Freuler F, Guerini D, Siehler S. Обратимая транслокация p115-RhoGEF с помощью рецепторов, связанных с G (12/13). J Cell Biochem. 2008; 104: 1660–70. pmid: 18320579
35. 35. Бодманн Э.Л., Кретт А.Л., Бюнеманн М. Усиление рецепторных ответов, вызванных длительным связыванием Gα13 и лейкемией RhoGEF. FASEB J. 2017; 31: 3663–3676. pmid: 28465324
36. 36. Рейнхард Н.Р., ван Хелден С.Ф., Энтони Э.К., Инь Т., Ву Ю.И., Годхарт Дж. И др.Пространственно-временной анализ активации RhoA / B / C в первичных эндотелиальных клетках человека. Научный доклад 2016; 6: 25502. pmid: 27147504
37. 37. Келли П., Стеммле Л.Н., Мэдден Дж. Ф., Филдс Т.А., Даака Ю., Кейси П.Дж. Роль семейства G12 гетеротримерных G-белков в инвазии рака простаты. J Biol Chem. 2006; 281: 26483–90. pmid: 16787920
38. 38. Мартин С.Б., Махон Г.М., Клингер М.Б., Кей Р.Дж., Саймонс М., Дер С.Дж. и др. Рецептор тромбина, PAR-1, вызывает трансформацию путем активации Rho-опосредованных сигнальных путей.Онкоген. 2001; 20: 1953–63. pmid: 11360179
39. 39. Kozasa T, Jiang X, Hart MJ, Sternweis PM, Singer WD, Gilman AG и др. p115 RhoGEF, белок, активирующий ГТФазу для Galpha12 и Galpha13. Наука. 1998; 280: 2109–11. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9641915 pmid: 9641915
40. 40. Иноуэ А., Исигуро Дж., Китамура Х., Арима Н., Окутани М., Шуто А. и др. Анализ выделения TGFα: точный и универсальный метод обнаружения активации GPCR. Нат методы.2012; 9: 1021–9. pmid: 22983457
41. 41. Навенот Дж.М., Фуджи Н., Пайпер СК. Активация Rho и Rho-ассоциированной киназы продуктом гена-супрессора метастазирования GPR54 и KiSS1 вызывает изменения морфологии клеток и способствует апоптозу. Mol Pharmacol. 2009. 75: 1300–6. pmid: 19286835
42. 42. Ayoub MA, Trinquet E, Pfleger KDG, Pin J-P. Дифференциальные способы ассоциации рецептора тромбина PAR1 с Galphai1, Galpha12 и бета-аррестином 1. FASEB J. 2010; 24: 3522–35.pmid: 20410441
43. 43. Mastop M, Bindels DS, Shaner NC, Postma M, Gadella TWJ Jr, Goedhart J. Характеристика спектрально разнообразного набора флуоресцентных белков в качестве акцепторов FRET для mTurquoise2. Научный доклад 2017; 7: 11999. pmid: 28931898
44. 44. Фриц Р.Д., Летцельтер М., Рейман А., Мартин К., Фуско Л., Рицма Л. и др. Универсальный набор инструментов для создания чувствительных биосенсоров FRET для визуализации сигналов во времени и пространстве. Sci Signal. 2013; 6: RS12. pmid: 23882122
45. 45.Хекман К.Л., Пиз Л.Р. Сплайсинг генов и мутагенез путем ПЦР-управляемого удлинения перекрытия. Nat Protoc. 2007; 2: 924–32. pmid: 17446874

работников отеля обеспокоены новым соперником: Алекса на стойке регистрации

Боссы еще не внедрили технологию распознавания лиц в отеле Royal Hawaiian. Но со своего места за стойкой регистрации в розовом неомавританском дворце с видом на пляж Вайкики Жан Тео-Гибни может предвидеть это.

«Marriott только что представила это в Китае», что позволяет гостям регистрироваться в своих комнатах, не утруждая себя формальностями на стойке регистрации, — заявила г-жа Мишель.Тео-Гибни, 53-летняя бабушка семи детей. «Похоже, они знают, что сократят наши рабочие места».

Подобные опасения витают в обширной сети отелей Marriott, крупнейшей в США. За последние две недели г-жа Тео-Гибни и тысячи других работников Marriott — повара и кассиры, посыльные и горничные — проголосовали за разрешение своему профсоюзу Unite Here проводить забастовки в десятках населенных пунктов от Вайкики до Бостона и Сан-Франциско. Диего в Детройт.

Наряду с обычными требованиями повышения заработной платы и повышения безопасности на рабочем месте, профсоюз поднимает еще одну проблему, требуя процедур для защиты работников, пострадавших от новых технологий и инноваций, которые они стимулируют.

«Вы не остановите технологии», — сказал президент Unite Here Д. Тейлор. «Вопрос в том, будут ли сотрудники сотрудничать с ним в развертывании или случайные прохожие, которых он сбивает».

В отличие от производственных рабочих, рабочие места которых были потеряны из-за автоматизации еще в 1950-х годах, работники низкооплачиваемой части сектора услуг до сих пор в значительной степени защищены от технологий, сокращающих рабочие места.

Многие заработали слишком мало, чтобы оправдать большие капитальные затраты на их замену.Согласно правительственным данным, типичный клерк в отеле или мотеле зарабатывает чуть более 12 долларов в час; консьерж чуть больше 13,50 долларов. И многие из выполняемых ими задач казались слишком сложными для автоматизации. Технологии меняют этот расчет.

Не существует эквивалентной меры по проникновению программных систем, таких как Alexa или сенсорных экранов, на рабочие места. Но в 2014 году автопроизводители в США имели 117 роботов на каждую 1000 рабочих, согласно исследованиям экономистов Дарона Аджемоглу из Массачусетского технологического института и Паскуаля Рестрепо из Бостонского университета.В сфере услуг их практически не было.

Но с развитием машинного обучения и других инноваций в области информационных технологий многие рабочие места в сфере обслуживания теперь потенциально находятся под угрозой. По сравнению с производством, инвестиции, необходимые для автоматизации некоторых задач в гостиничном секторе, таких как стойка регистрации или услуги консьержа, вероятно, будут относительно низкими.

Мария Мендиола, консьерж в San Jose Marriott, обеспокоена тем, что соглашение Amazon разместить свое устройство Echo в гостиничных номерах в отелях Marriott в конечном итоге сделает ее положение бессмысленным.«Алекса может сделать мою работу в будущем», — сказала она.

В Sheraton Waikiki, рядом с Royal Hawaiian, кассиры в пляжном лаундже беспокоятся о недавно развернутой компьютерной системе, которая позволит серверам закрывать свои собственные чеки, делая кассиров ненужными.

В продаже есть автоматические посудомоечные машины; машины для переворачивания гамбургеров и смешивания коктейлей; роботы для доставки еды и напитков в номер или помощи в бронировании столика в ресторане.

Новые технологии изменяют конфигурацию рабочего места иным образом.Швейцары теряют чаевые, поскольку гости обращаются к Uber и Lyft вместо обычных такси. Так же поступают посыльные, когда гости используют приложение для доставки еды Seamless вместо обслуживания номеров.

Сколько рабочих мест займет технология? Отельерам еще предстоит выяснить, как гости отреагируют на более технологичный опыт. Представитель Marriott заявила в своем заявлении, что сеть не использует технологии для сокращения рабочих мест, а «персонализирует обслуживание гостей и улучшает их пребывание».

Клифф Аткинсон, старший вице-президент MGM Resorts по вопросам гостеприимства, сказал, что новые технологии изменили должностные инструкции в отелях его сети, но не привели к сокращению рабочих мест.Клерки на стойке регистрации, замененные киосками автоматической регистрации, используются в качестве «послов в вестибюле» или консьержей.

Тем не менее, история показывает, что самой сильной мотивацией к развертыванию новых технологий была возможность снизить затраты на рабочую силу. По оценкам профессоров Асемоглу и Рестрепо, с 1993 по 2007 год каждый новый робот сокращал 5,6 рабочих мест и снижал заработную плату на 0,5 процента.

По мере того, как технологии становятся лучше и дешевле, появляется множество новых задач, которые они могут взять на себя. «Это новая, неизведанная область для нашей компании и нашей отрасли в целом», — сказал г-н.- сказал Аткинсон. «Мы говорили об одном или двух брендах, которые полностью автоматизированы и самообслуживаются для гостей».

Ежедневный бизнес-брифинг

Дэвид Аутор, экономист Массачусетского технологического института, говорит, что можно предвидеть будущее, в котором — как это сделали авиакомпании — отели будут использовать людей заботиться об элитных гостях и автоматизированные системы для всех остальных. По утверждению профессора Автор, затраты на рабочих значительно превышают их почасовую заработную плату.Они болеют, берут отпуск и требуют менеджеров. «Люди беспорядочные», — отметил он. «Машины просты».

В прошлом году Глобальный институт McKinsey опубликовал отчет, в котором прогнозируется, что технологии приведут к 30-процентному сокращению рабочих мест в сфере общественного питания и жилья с 2016 по 2030 год. Это почти соответствует сокращению на 38 процентов рабочих мест в обрабатывающей промышленности с 1960 по 2012 годы.

Профсоюзы предпочли бы, чтобы история производства не повторялась в сфере услуг. «Мы пытаемся опередить это», — сказал Ананд Сингх, президент местного отделения Unite Here в Сан-Франциско.«Мы не луддиты, но мы ищем настоящего голоса за столом».

Международное братство водителей грузовиков также обеспокоено технологией, стремительно проникающей в настоящее. В ходе переговоров по контракту с United Parcel Service в этом году профсоюз сделал смелое предложение: запретить использование дронов или автономных транспортных средств для доставки посылок. Но в сентябре, когда профсоюз разослал соглашение членам для ратификационного голосования, такого положения не было.

Эдвард Виткинд, до этого года возглавлявший Департамент транспортных перевозок компании A.F.L.-C.I.O. заявил, что профсоюзы не смогут остановить развитие технологий, даже если они попытаются это сделать. «Может быть, вы сможете остановить это с помощью одного раунда торга или замедлить его», — сказал он. «Но инновации продолжаются 100 лет и никогда не прекращаются».

И он отметил, какой может быть цена успеха: «Завоевываем ли мы будущее для рабочих? Нет, если компания обанкротится ».

Лучшей стратегией могло бы быть требование высказывать свое мнение о том, как развертываются технологии.

Предварительная сделка Teamsters с U.P.S.например, призывает к предварительному предупреждению профсоюзов за шесть месяцев о развертывании технологий и к созданию комитета с представителями профсоюзов и компаний, который будет вести переговоры «относительно последствий предлагаемых технологических изменений».

Unite Идет по аналогичному пути. Г-н Сингх перечислил цели профсоюзов в отношении контрактов Marriott: «Мы хотим поговорить о том, как технологии могут помочь в выполняемой нами работе и облегчить ее суровость, как проходят обучение наших членов, что происходит с работниками, которые в противном случае были бы отмечены как лишние. , как наши участники перемещаются для достижения успеха или нанимаются на другие рабочие места.”

В июне профсоюзу впервые удалось включить защиту от технологических изменений в свои контракты, касающиеся рабочих на объектах MGM Resorts и Caesars Entertainment в Лас-Вегасе. Рабочие будут обучены выполнять рабочие места, созданные или модифицированные с помощью новых технологий, что позволит им участвовать в приросте производительности. Контракты также предусматривают, что компания пытается найти работу для уволенных работников. Но ключевым достижением профсоюза было предупреждение о развертывании технологий за 180 дней.

«Они должны сообщить нам об этом, показать прототипы и провести с нами переговоры», — сказал г-н Тейлор. «В конце концов, они могут двигаться вперед, но это дает нам время, чтобы понять последствия».

Если бы они могли выбрать прецедент из американской трудовой истории, сегодняшние профсоюзные лидеры могли бы пойти по пути Международного союза береговых берегов и складов.

В 1960-х и 1970-х годах докеры были поражены одним из самых революционных технических нововведений 20-го века: контейнерами.Контейнеры одним ударом сократили время и количество рабочих, необходимых для загрузки корабля, что позволило сэкономить огромные суммы денег.

Вместо того, чтобы пытаться остановить большие коробки, профсоюз, покрывающий грузчиков на Западном побережье, потребовал долю добычи: богатые пенсионные пакеты для уволенных рабочих и солидное вознаграждение для тех, кто остался. В результате грузчики, работающие полный рабочий день круглый год, в настоящее время зарабатывают в среднем от 168 000 до 186 000 долларов в год.

Но чтобы заключить такую ​​сделку, нужно много энергии.Профсоюз портовых компаний может закрыть порты по своему желанию, что повлечет за собой огромные расходы для грузоотправителей. Для рабочих, не обладающих таким влиянием, успехи, достигнутые грузчиками, кажутся недосягаемыми.

Объединиться Здесь не бессильно. Согласно государственной статистике, по всей стране только 7,6% работников индустрии размещения состоят в профсоюзах. Но в Сан-Франциско, например, Unite Here представляет 89 процентов работников отелей класса А. Отчасти поэтому горничные в Сан-Франциско зарабатывают 22 доллара.64 в час, отмечает профсоюз, что более чем вдвое превышает средний показатель по стране, составляющий 10,09 доллара.