Лада с кросс дата выхода: Обновлённая LADA Vesta SW Cross — Много Курсов

Содержание

LADA Granta Cross 2021 года: фото, цены, комплектации, характеристики

• Подушка безопасности водителя
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Розетка 12V

• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС

• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.

• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань с водоотталкивающей пропиткой/экокожа с отстрочкой и логотипом Quest на передних сиденьях

• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Багажная сетка-карман
• Сетка для удержания груза в багажнике
• Поддон багажника резиновый

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние

• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски оригинальные
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира

• Подголовники задних сидений 2 шт.

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань с водоотталкивающей пропиткой/экокожа с отстрочкой и логотипом Quest на передних сиденьях

• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка

• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

известна дата производства — журнал За рулем

Производство спецверсии Cross приподнятого хэтчбека начнется во второй половине этого года. Вероятнее всего, машину покажут публике на международном автосалоне в Москве в конце августа.

Lada XRAY Cross

Материалы по теме

Фактически производство модели начнется в июне 2018 года, но завод должен выпустить около 400 автомобилей, что может говорить о том, что речь идет об установочной партии. Затем предприятие будет постепенно наращивать выпуск данной модификации. Это стало известно из производственного плана завода для данной модели на 2018 год, который опубликован в телеграм-канале «Русский автомобиль». Всего до конца года АВТОВАЗ выпустит чуть более 10 тысяч приподнятых хэтчбеков Lada XRAY Cross, это примерно в три раза меньше запланированного.

Подробностей о серийном варианте Лады XRAY Cross пока нет. Известно лишь, что машина не получит полный привод: его интеграция сделала бы машину очень дорогой и неконкурентоспособной на рынке.

Lada XRAY Cross

По неофициальной информации, даже дорожный просвет останется прежним — 195 мм. Lada XRAY Cross будет отличаться иными бамперами с блестящей пластиковой псевдозащитой нижней части кузова и моторного отсека спереди и сзади и новым эксклюзивным для этой версии цветом окраски кузова. В целом он практически не будет отличаться от того аэродинамического обвеса, которым был оснащен концепт, показанный заводом в Москве в 2016 году.

По аналогии с универсалом Lada Vesta SW Cross салон машины будет иметь двухцветное исполнение. Также машина может стать второй после обновленной Лады Гранты моделью, которая получит систему дистанционного управления Lada Connect.

Lada XRAY Cross

Хэтчбек будет доступен в очень богатой комплектации и исключительно с 1,8-литровым двигателем мощностью 122 л.с. А вот коробки передач останутся обе: 5-ступенчатая механика и классический робот 5АМТ на ее базе.

Фото: АВТОВАЗ

Чем порадует АвтоВАЗ в 2020 году («Российская газета»)

В 2019 году российский бренд Lada расширил модельный ряд за счёт «заряженного» седана Vesta Sport, «вседорожного» универсала Granta Cross, «околоспортивной» Granta Drive Active и «автоматических» Xray Cross и семейства Vesta.

Дальше перед Волжским автогигантом стоят задачи по выпуску новых и обновлению текущих моделей Lada. Примечательно, что для разработки новых продуктов завод активно набирает инженеров-технологов, конструкторов и дизайнеров.

Ждать в текущем году выхода принципиально новых моделей Lada не стоит. Ведь в августе, по уже сложившейся традиции, марка завалит Московский автосалон своими премьерами.

Наверняка завод покажет серийную версию Niva, он же кроссовер повышенной проходимости, а также компактный городской SUV по мотивам XCode, «каблучок» с рабочим названием Van, концепт бюджетника Granta второго поколения, рестайлинговые Vesta FL и Xray FL. Выход новинок растянется на последующие два года, но пока спустимся с небес на землю, а именно в реалии 2020 года.

1. Lada 4×4 FL — обновление самой старой модели

В середине декабря 2019 года АвтоВАЗ запустил серийное производство обновлённой Lada 4×4 с заводским обозначением FL (Facelift). Первые товарные экземпляры модернизированной модели активно отгружают в дилерскую сеть, продажи должны стартовать в текущем месяце.

После обновления снаружи обычную Lada 4×4 с алюминиевыми бамперами можно идентифицировать только по наличию штатной антенны на крыше. Классические «нивовские» бампера останутся на некоторых версиях. Lada 4×4 в городской модификации Urban отличается передним бампером с интегрированными противотуманными фонарями. Также установлены новые опоры силового агрегата (снижающие уровень вибраций), улучшенный пакет шумо-виброизоляции на панелях кузова, ограничители и трёхкамерные уплотнители дверей.

Главное — Lada 4×4 FL получила новый интерьер. В салоне появилась оригинальная передняя панель с электронным блоком управления климатической установкой, увеличенными воздуховодами, вместительным бардачком, комбинацией приборов от Lada Priora (по стилистике схожа с Granta FL, Vesta, Xray). Внедорожник оснащается более удобными сиденьями с развитой боковой поддержкой и широким задним диваном с двумя подголовниками. Передние кресла имеют модернизированный механизм складывания и могут подогреваться, а водительское сиденье обзавелось боковой подушкой безопасности.

Наконец, внутреннее убранство может похвастать формованным потолком с солнцезащитными козырьками, плафоном освещения и блоком системы ЭРА-ГЛОНАСС, а также новой обивкой стоек лобового стекла, потолочными поручнями. Изменился и центральный тоннель, в котором присутствует ниша под смартфон, две розетки на 12В, подстаканники, блок электрической регулировки боковых зеркал, кнопки стеклоподъёмников и обогрева сидений.

По технике Lada 4×4 по-прежнему оснащается 1,7-литровым бензиновым двигателем мощностью 83 л.с. и пятиступенчатой механической коробкой передач.

Отметим, модернизация Lada 4х4 проходит в два этапа. Первый осуществлён, второй случится в нынешнем году. В рамках дальнейшего рестайлинга внедорожник должен обзавестись оригинальным рулевым колесом с подушкой безопасности (!), другой облицовкой рулевой колонки, дверными картами нового образца, более эргономичными рычагами управления коробкой передач, «блокировкой-понижайкой». Дело в том, что на момент премьеры обновлённого внедорожника у завода не хватило денег на установку той же фронтальной водительской подушки, а машину в производство надо было запускать.

Не исключено, что в комплексную модернизацию Lada 4×4 войдут и следующие предполагаемые доработки: автоматическое включение дворников при включении омывателя, замена самих форсунок, программируемая пауза работы стеклоочистителей, выключение ближнего света и габаритов при выключении зажигания. Инженеры намерены внедрить подлокотник сиденья водителя, фильтр для поступающего в салон воздуха, а также адаптировать обивки передних дверей для установки акустических динамиков, уменьшить загрязняемость ручки двери багажника, а цвет полки багажника приблизить к основному цвету отделки салона.

Надеяться на существенные улучшения по части техники не приходится. Хотя в своё время планировалось установить под капот Lada 4×4 1,6-литровый «атмосферник» и оснастить кнопкой электроблокировки дифференциала.

Объем нововведений зависит от финансовых успехов АвтоВАЗа. Завод действительно хочет улучшить легендарный внедорожник по многим параметрам, но серьёзное вмешательство в конструкцию машины советской разработки приведёт к удорожанию машины, а это неминуемо разрушит её рыночное преимущество.

Впрочем, времени у предприятия предостаточно, срок производства классической Lada 4×4 (Нива) продлен вплоть до 2026 года, когда модели исполнится 49 лет.

2. Largus FL — фейслифт лицензионной модели

Ещё одна модель, давно требующая к себе внимания — универсал Lada Largus. В линейке бренда Lada автомобиль появился в 2012 году и является лицензионной копией Dacia Logan MCV первого поколения 2006 года (!), адаптированной под российские условия. Доподлинно известно, что АвтоВАЗ активно работает над проектом фейслифта Lada Largus.

Изначально появление Largus FL ожидали к осени 2019 года, но в прошлом году было проведено лишь легкое обновление универсала, в рамках которого Largus получил решетку радиатора с двумя тонкими ламелями в новой стилистике марки.

Помимо этого, модель теперь имеет эмблему «ладьи» нового образца на решетке радиатора и ступице рулевого колеса, а также новый шильдик Lada (с большим расстоянием между буквами) на левой дверце багажника. Появились такие мелочи, как функция отключения головной светотехники при выключении зажигания, черное покрытие центральной стойки кузова, усиленная тонировка задней полусферы остекления, новая ткань обивки сидений.

Коммерческая модель Lada Largus показывает хороший уровень спроса и соответственно стабильные продажи. Поэтому завод не торопится с глубоким рестайлингом, который в итоге запланирован на 2020-2021 годы. Важным требованием Largus FL является то, что по стоимости он должен остаться в той же нише.

Универсал примерит новую переднюю часть кузова в Х-стиле, отражающую принадлежность к Lada Vesta, Xray и Granta FL. Появятся другие бамперы, иная оптика, решетка радиатора, возможно, изменится форма капота и передних боковых крыльев. Сбоку автомобиль должен остаться прежним. Ожидается, что после фейслифта автомобиль получит обновленный или полностью новый салон.

По технической части изменения вероятны. В прошлые годы звучали обещания начать оснащать Lada Largus 1,8-литровым двигателем (122 л. с.) с индексом ВАЗ-21179 и автоматической трансмиссией. По нашим данным, АвтоВАЗ задумывается над установкой на Lada Largus 122-сильного мотора, тем более, что ещё на стадии разработки агрегат рассчитывался для внедрения на Lada Vesta, Xray, непосредственно Largus и «Ниву» нового поколения. В качестве «бюджетной» альтернативы «автомата» тольяттинский автогигант может рассмотреть автоматизированную механическую трансмиссию («робот»). Подобный опыт уже испробован на соплатформенном Xray.

Кстати говоря, с момента выхода из всех агрегатных нововведений универсал удостоился лишь замены «реношных» двигателей на «вазовские». С октября 2017 года АвтоВАЗ начал продажи Lada Largus с 16-клапанным двигателем ВАЗ-21129.

106-сильный «атмосферник» вытеснил из гаммы мотор Renault K4M. В 2016-м завод заменил 84-сильный Renault K7M на ВАЗ-11189 мощностью 87 л.с. В Одобрении типа транспортного средства (ОТТС) за 2018 год в Lada Largus были зафиксированы изменения в виде установки 5-ступенчатой механической коробки передач с индексом ВАЗ-21809.

3. Vesta SW Sport — в погоне за седаном

Почти год назад, 31 января 2019 года, начались продажи седана Lada Vesta Sport. Модель стала самой дорогой серийной Lada в истории, но возможно это звание является временным. Давно сертифицирован универсал Vesta SW Sport, судьба которого напрямую зависит от успеха продаж спорт-седана.

Несмотря на наличие ОТТС и прототипов, компания находится в поиске рентабельной концепции для рынка. Всё зависит от окупаемости проекта, вложенных инвестиций и объёмов выпуска.

Известно, что проект Vesta SW Sport не закрыт и машина всё-таки увидит свет. Только в период с 31 января по 1 марта прошлого года официальные дилеры марки реализовали 217 экземпляров Vesta Sport (при годовом объёме в 1200 штук). Да, нужно дождаться итоговых цифр продаж седана за год. Но есть ощущение, что весь запланированный на 2019 год тираж Vesta Sport в большей степени реализован.

К тому же, степень унификации обвеса между двумя Sport-версиями составляет 100%, а значит завод не понесёт больших затрат на вывод перспективной новинки.

Так что вполне можно ждать «заряженного» универсала Vesta SW, которую множество количество раз замечали на дорожных тестах. Модель создаст вокруг себя новый класс автомобилей в бюджетном В-сегменте. По внешнему виду и доработкам шасси Vesta SW Sport полностью идентична Vesta Sedan Sport, с поправкой на тип кузова.

В остальном спорт-универсал будет схож со спорт-седаном и получит спортивный аэродинамический обвес, расширенную колею с передними пластиковыми крыльями, оригинальные 17-дюймовые диски на пяти болтах. В шасси появятся новые амортизаторы и стойки, тормоза с дисками увеличенного диаметра, заниженная подвеска с клиренсом в 162 мм.

В салоне установят новые сиденья с развитой боковой поддержкой, обновленную комбинацию приборов, черный потолок, атмосферную LED-подсветку, декоративные элементы под «карбон», накладки на педалях и порогах. Рулевое колесо, рукоятка коробки передач, ручник и подлокотник будут отделаны кожей.

Как и седан Vesta Sport, универсал Vesta SW Sport оснастят 1,8-литровым двигателем, мощностью 145 л. с. и крутящим моментом 187 Нм. Доработанный мотор отличается новыми распредвалами с измененным профилем (увеличен подъем кулачков), повышенным давлением в топливной системе и оригинальной калибровкой контроллера. Силовой агрегатируется с 5-ступенчатой механической коробкой передач JR5. Максимальная скорость спорт-седана составляет 198 км/ч, время разгона до 100 км/ч — 9,6 секунды.

Стоит напомнить, ещё в 2017 году АвтоВАЗ зарегистрировал новые товарные знаки — Vesta S-Line и Vesta R.

По аналогии с другими автомобильными компаниями можно предположить, что под приставкой S-Line завод «скрывает» «лайтовую» версию Vesta Sport в агрессивном обвесе, с той же спортивной подвеской, но без форсированного мотора.

С Vesta R дилемма. Vesta Sport оснащается 145-сильным двигателем, тогда приставку R должна получить самая мощная модификация Vesta. По слухам, рассматривается «форсировка» 1,8-литрового мотора до 180 л.с и установка турбомотора от Альянса Renault-Nissan-Mitsubishi серии H5Ht 1. 3 TCe 150. К слову, обычно литера «R» в названиях моделей подразумевает и установку нового обвеса, а также глубокую перенастройку иных узлов, вроде подвески, трансмиссии и др.

4. Vesta FL — рестайлинг флагмана

25 ноября 2019 года стартовали продажи Lada Vesta с долгожданной связкой бесступенчатой автоматической трансмиссией Jatco JF015E и двигателем Renault h5Mk объемом 1,6 литра (113 л.с.). Некое промежуточное обновление случилось спустя ровно четыре года после начала продаж модели.

За это время семейство Vesta успело пополниться седаном, универсалом, их кросс-версиями, модификациями с приставкой CNG и Sport. Lada Vesta получила ряд опций и доработок, было устранено большинство «детских болячек», вроде посторонних звуков в подвеске, а также установлен новый стабилизатор, новые ограничители дверей и многое другое.

С появлением новой модификации Lada Vesta AT впервые в истории бренда Lada стал применяться электропривод складывания зеркал. Появились обогрев рулевого колеса, бескаркасные щетки стеклоочистителя, более глубокие подстаканники, чёрный потолок, функция подсветки поворотов и атмосферная подсветка салона, обычные седаны теперь оснащаются антенной «акулий плавник» и задним диваном со встроенным подлокотником. Цветовая гамма семейства пополнилась долгожданной сине-голубой эмалью «Дайвинг» и свежим черным цветом «Маэстро».

На этом АвтоВАЗ не собирается останавливаться. К 5-летнему юбилею Vesta необходимо кардинальным образом подготовить. Обновить внешность, изменить салон и поставить резвый мотор.

Всё это может исполниться уже в конце 2020 года или в начале 2021 года. «Российская газета» склоняется к текущему году и датам 25 сентября (дата серийного производства) или 25 ноября (дата старта продаж), когда модели исполнится пять лет и пора будет устроить полноценный рестайлинг.

Lada Vesta с заводским обозначением Facelift получит обновлённый дизайн экстерьера и абсолютно новый интерьер. Под капотом прогнозируется появление вышеописанного 1,3-литрового турбомотора (150 л.с.) от Renault Arkana.

Предполагается, что у Lada Vesta FL появятся новые бампера, фары и фонари, решетка радиатора, крышка багажника иной формы, при этом боковая часть кузова останется прежней. Машину оснастят обновлённым блоком управления стеклоподъёмниками с авторежимом, а форсунки стеклоомывателя «переедут» с капота на «жабо» автомобиля.

В рамках фейслифта Lada Vesta обзаведется полностью оригинальной передней панелью с современной архитектурой, дверными картами и центральным тоннелем пола. Особенностью интерьера станет огромный «парящий» тачскрин мультимедийной системы, который объединен с блоком климатической установки. В нижней части центральной консоли будет предусмотрена большая ниша для смартфона (станет доступна опция беспроводной зарядки).

Изменится дизайн селектора механической коробки передач, возле закрытой секции с подстаканниками (как на автомобилях классом выше) будет кнопка электронного ручника и шайба-селектора выбора режима движения Lada Ride Select. Сиденья останутся прежними, но в них должен поменяться угол наклона подушки, подлокотник станет регулируемым, рулевое колесо сменит дизайн и станет меньшего диаметра, на панели будет доступна кнопка «старт-стоп», в комбинации приборов будет отображаться два колодца и большой дисплей бортового компьютера.

Поменяется также форма воздуховодов, ручек открывания дверей и декоративных элементов, в боковинах центрального тоннеля появятся кармашки для мелочёвки.

Новая LADA Vesta SW Cross в салоне дилера

Кузов
Колесная формула / ведущие колеса	4 х 2 / передние
Расположение двигателя	переднее поперечное
Тип кузова / количество дверей	универсал / 5
Количество мест	5
Длина / ширина / высота, мм	6 л 16-кл. (113 л.с.), АТ»> 4424 / 1785 / 1537
База, мм	2635
Колея передних / задних колес, мм	1524 / 1524
Дорожный просвет, мм	203
Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом вариантах, л	480 / 825		(122 л.с.), 5МТ»>
Двигатель
Код двигателя	h5M
Тип двигателя	бензиновый
Система питания	впрыск топлива с электронным управлением
Количество, расположение цилиндров	4, рядное
Рабочий объем, куб. см	с.), АТ»> 1598
Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин.	83 (113) / 5500
Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин.	152 / 4000
Топливо	бензин, min 92
Динамические характеристики
Максимальная скорость, км/ч	170		8 л 16-кл. (122 л.с.), 5МТ»>
Время разгона 0-100 км/ч, с	12,2
Расход топлива
Городской цикл, л/100 км	9,6
Загородный цикл, л/100 км	6,1
Смешанный цикл, л/100 км	7,4
Масса
Снаряженная масса, кг	6 л 16-кл. (113 л.с.), АТ»> 1280…1350
Технически допустимая максимальная масса, кг	1730
Максимальная масса прицепа без тормозной системы / с тормозной системой, кг	600 / 900
Объем топливного бака, л	55
Трансмиссия
Тип трансмиссии	АТ	6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ»>
Передаточное число главной передачи	3,9
Подвеска
Передняя	независимая, типа Макферсон, пружинная, с телескопическими гидравлическими или газонаполненными амортизаторами и стабилизатором поперечной устойчивости
Задняя	полузависимая, пружинная, с телескопическими гидравлическими или газонаполненными амортизаторами
Рулевое управление
Рулевой механизм	6 л 16-кл. (113 л.с.), АТ»> шестерня-рейка
Шины
Размерность	205/50 R17 (93/89, W/V)

Qualcomm представила 5G-модем нового поколения Snapdragon X65 со скоростью до 10 Гбит/с

Qualcomm анонсировала новейший модем 5G — Snapdragon X65. Он станет преемником прошлогоднего Snapdragon X60, который только начал появляться в реальных устройствах в качестве составной части однокристальной системы Snapdragon 888. Qualcomm обещает, что новый модем будет намного быстрее, и обеспечит скорости до 10 Гбит/с как в автономных, так и неавтономных сетях 5G (при условии поддержки оператором).

Пройдёт какое-то заметное время, прежде чем модем X65 появится в конечных устройствах. Если судить по прежней практике, он, скорее всего, не появится до запуска следующей флагманской однокристальной системы Snapdragon — предположительно, этот чип будет объявлен в декабре, а устройства на нём появятся в следующем году. Впрочем, есть вероятность увидеть X65 раньше в новых iPhone.

Максимальная скорость скачивания у новинки достигла психологической отметки в 10 Гбит/с против 7,5 Гбит/с у прошлогодней модели. Это самая яркая характеристика, даже если такая заявленная скорость в значительной степени бессмысленна, поскольку практически ни одна сеть 5G ещё не может обеспечить такую пропускную способность. Но это означает, что сотовой связи нового поколения есть куда развиваться.

Будущие улучшения 5G заложены и в других новшествах X65: прежде всего, модем стал первым совместимым с недавно утверждёнными спецификациями 3GPP Release 16. Фактически, речь идёт о новом шаге в развитии 5G, который призван улучшить такие показатели, как массовое подключение MIMO, энергопотребление, позиционирование через 5G и многое другое. Версия Release 16 также призвана помочь в развёртывании 5G помимо потребительского сектора также в промышленности и на предприятиях благодаря лучшей поддержке нелицензированного спектра и непубличных сетей.

В связи с этим Qualcomm заявила, что архитектура модемной системы X65 может обновляться, что позволяет компании со временем добавлять новые возможности, по мере развёртывания 3GPP Release 16. Программные обновления такого рода позволят будущим смартфонам и другим устройствам дольше оставаться актуальными.

Наряду с новой модемной системой Qualcomm также представила антенну Qualcomm QTM 545 mmWave — это уже 4-е поколение антенн миллиметрового диапазона компании. Её размер остался прежним, но мощность возросла, а также была добавлена поддержка полного диапазона глобальных частот mmWave.

Наконец, Qualcomm представила технологию настройки антенны на основе ИИ: по словам производителя, она позволяет значительно повысить производительность благодаря технологиям машинного обучения. Например, Qualcomm заявила, что новая система на 30 % точнее определяет, как человек держит телефон в руке, что позволяет оптимизировать подключение; также технология увеличивает время автономной работы за счёт более эффективной работы соединения.

Ожидается, что Snapdragon X65 появится в продаже в конце 2021 года.

Если вы заметили ошибку — выделите ее мышью и нажмите CTRL+ENTER.

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов. В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов.Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом для изучения взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше, чем размер типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале.Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли ученики в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Рисунок 1 — Фёрстеровский резонансный перенос энергии Яблонски Диаграмма

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на большей длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами, позволяет локализовать их в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, по-видимому, совпадают (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли происходит взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов. Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же районе, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения потребностей высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Флуоресцентная визуализация с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает от относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применяя методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденных состояний между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы нарисованы пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на , рис. 1, ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий для широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов для мечения специфических внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привела к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты подобного рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие средства управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, циклическая эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C omplementation; BiFC ) или для объединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция, названный cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP (названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов в начало седьмой цепи beta в основной цепи флуоресцентного белка. Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных N и C концов и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками, могут быть слиты с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

Рисунок 2 — Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения активности протеазы

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Два общих подхода можно использовать для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на изменениях протонирования нативного (дикого типа) GFP, что приводит к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, которые имеют пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в реальном времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, фосфопептид-связывающий домен связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что с помощью этой простой стратегии можно создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рисунок 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. Как правило, датчик демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокий уровень динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать сенсор во время индукции апоптоза. За последние несколько лет было опубликовано большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергообмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью событий, зависящих от растворителя, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Рисунок 3 — Переменные коэффициента расстояния и ориентации Фёрстера в FRET

Формула 1 — Эффективность FRET

E _FRET = 1 / [1 + (r / R ₀ ) ⁶ ]

, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно рассчитать для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Ферстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на Рисунок 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний менее R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний более R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на Рисунок 3 (a) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET может эффективно использоваться в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только high-FRET и low-FRET , или просто наличие и отсутствие FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или забуференном) растворе определяется по довольно простому уравнению с хорошо установленными входными параметрами:

Формула 2 — R (0)

R ₀ = [2,8 x 10 ¹⁷ × Κ ² × Q _D _D × Дж (λ)] ^1/6 нм

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. Рисунок 3 (b) , где представлена сводка углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) — квантовый выход донора, Ε (A) — максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) — интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает на то, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами примерно так же, как положение радиоантенны может влиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень выравнивания определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может варьироваться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Практически для любой реальной ситуации Κ (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы отрегулировать это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам). Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другие параметры, которые могут влиять на FRET, — это квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Рисунок 4 — Интеграл спектрального перекрытия возбуждения и излучения

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений во взаимодействиях белок-белок, которые возникают из-за изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как в другом канале преобладает систематический шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше всего использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET. В связи с тем, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по межбелковому взаимодействию, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия является фиксированной и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозных помех (также называемых перекрестными помехами и кроссоверами ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. Рисунок 5 ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора ( Рисунок 5 (а) ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора значительно перекрываются (, рис. 5 (b), ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, хорошо разделенных спектрально, — отличный механизм для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имея значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждая из описанных выше проблем может быть смягчена (или частично) осознанным выбором пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Рисунок 5 — Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRET

Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET. Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, фиг. 5 (а), ), так и в спектрах излучения (, фиг. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (а) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP ( Рисунок 5 (b) ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всей области излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, потому что каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, что требует четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, возникающих в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать самые простые подходы. Список методов, которые были разработаны для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
Фотообесцвечивание акцептора — Также известный как декушение донора , этот метод измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — изменение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
Spectral Imaging — возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
Fluorescence Polarization Imaging — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны. Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — это самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Чувствительное излучение

Также обычно называемый двухцветной визуализацией с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереалистичном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров, тогда сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, с помощью этого подхода сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображения для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для сенсибилизированной эмиссионной FRET визуализации были разработаны различные корректирующие подходы. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Рисунок 6 — Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRET

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированная эмиссия является особенно привлекательной техникой при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, показанный на Рисунок 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля, когда пептидный линкер ферментативно расщепляется. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцептор фотообесцвечивания

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора направляется к акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET происходит между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться, когда акцептор удаляется. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и чтобы акцептор фотообесцвечивался примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормализации этого значения к интенсивности донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, что ограничивает его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 представляют собой примеры FRET-анализа сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцепторов с использованием визуализации живых клеток. На фигуре 6 (a) показана эпителиальная клетка карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующая биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) на фиг.6 (d) — (f) были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фиг. 6 (d) ; зеленый) и Cy5 ( фиг.6 (e) ; красный), конъюгированные с B-субъединицей холерного токсина и нацеленные на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рис. 6 (e) ) увеличивает расщепление донора (увеличение зеленой флуоресценции на рис. 6 (f) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале Только.

Флуоресцентная микроскопия для непрерывной визуализации (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM в некоторой степени связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

Рисунок 7 — Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET микроскопии

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в наносекундной области жизни сложны, а оборудование дорого в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Более того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но и различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Метод построения спектральных изображений требует специального оборудования, но превосходные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Принципиальным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в Рис. 7 (a) — это изменения в уменьшении времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада показывает время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Площадь между кривыми представляет энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль эмиссии от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на Рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (приблизительно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и становится очень похожим на спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивности на 475 и 529 нм этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Обработка изображений поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET. Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом отбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, тогда излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Рисунок 8 — Изображение FRET с поляризационной анизотропией

Основная сила этого подхода — простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал / шум. Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображений, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, так как это может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не является хорошим подходом для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET должны ограничиваться получением изображений с помощью объективов с числовой апертурой 1,0 или меньше.

Представлено в Рисунок 8 — графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков ( Рисунок 8 (а) ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации. Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( Рисунок 8 (b) ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( Рисунок 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансный перенос энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (от примерно 450 до 650 нанометров), тем самым заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET в каждом цветовом классе. Недавние достижения в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы инженерии белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. таблицу 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей области спектра, и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки можно легко визуализировать в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой спектральной области широко применялись в качестве доноров FRET в паре с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета демонстрирует более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с Aequorea CFP и намного более фотостабилен. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным mECFP и mCerulean в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки в голубом спектральном классе. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации. Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP, названный CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ), был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого цвета. и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Введение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET. Названные super CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных меток слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циан-репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нм соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую же яркость, что и Cerulean.

Таблица 1 — Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET 905 905 90522

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость. Недавно появилось новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотек в голубых белках. Полученный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальной альтернативой FRET-партнеру с зеленым излучением для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нм и эмиссию при 505 нм. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был подробно описан в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из наиболее универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны обеспечивать кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. Таблица 1 ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации тегов слияния, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), также был получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его владения FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом из всех, когда-либо созданных и демонстрирует приемлемую фотостабильность. Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Венеру и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой при разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно развивающимися партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще не установлена. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но, предположительно, могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо работает с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем введения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

Рисунок 10 — Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором

На рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP ( Рисунок 10 (a) ), EGFP ( Рисунок 10 (b) ), EYFP ( Рисунок 10 (c) ) и mOrange ( Рисунок 10 (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка с дальним красным излучением.По мере того как спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (области, заштрихованные красным и синим цветом соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически никакого перекрытия в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку цветовая палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение для экспериментов, требующих повторной визуализации.Однако mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый цвет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (названная mOrange2 ) со значительно увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для локализации и исследований FRET и может оказаться эффективным в большом количестве конструкций биосенсоров. Самым ярким флуоресцентным белком в любом спектральном классе является тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов в локализации, а также для повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Тандемно-димерная версия (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (в два раза больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияния, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генно-инженерных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые дополнительно снижают тенденцию этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красные белки mFruit , mApple , mCherry и mStrawberry (пики эмиссии при 592, 610 и 596 нанометрах соответственно) имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации. Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, представляющих первые настоящие дально-красные генно-инженерные зонды. Наиболее потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как Изумруд и Цитрин (см. Рисунок 10 ) .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих разную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимум излучения 635 нанометров). Хотя яркость «Катушки» составляет всего две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, области, которая важна для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к образованию мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок показывает яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для экспериментов по локализации и FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие происходит из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое акцепторное возбуждение. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скорости созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты с FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет. Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему обеспечивают наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует совершенной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET с использованием флуоресцентных белков должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут произвести дальнейшую революцию в этом новом подходе к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или уточнить у системного администратора.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файлах cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Interbase FRET в РНК: от А до Я | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Interbase FRET может предоставить очень подробную информацию о расстоянии, ориентации и динамике нуклеиновых кислот, дополняя существующие методы структуры и динамики.Здесь мы сообщаем о первой паре аналогов основания РНК FRET, состоящей из донора tC ^O и неэмиссионного акцептора tC _nitro. Акцепторный рибонуклеозид здесь синтезирован и впервые включен в РНК. Эта пара FRET точно сообщает среднюю структуру РНК A-формы, и ее полезность для исследования структурных изменений РНК демонстрируется путем мониторинга перехода от A- к Z-форме РНК. Наконец, измеренные данные FRET сравнивали с теоретическими паттернами FRET, полученными из двух ранее описанных структур Z-RNA PDB, чтобы пролить новый свет на эту неуловимую конформацию РНК.

ВВЕДЕНИЕ

Биологические роли различных РНК жизненно важны и разнообразны и включают кодирование, регуляцию и экспрессию генов, а также катализ. Это отражает важность вторичной и третичной структуры и динамики для их функции, что подчеркивает необходимость разработки инструментов, которые могут исследовать такие параметры (1). Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это процесс, в котором энергия передается без излучения между донорным и акцепторным хромофором.Эффективность этого процесса сильно зависит как от расстояния, так и от ориентации между хромофорами; следовательно, может быть получена информация о структуре и / или относительном положении различных меченных донорами и акцепторами биомолекул в физиологических условиях in vitro, или даже в живых клетках (2, 3). FRET особенно ценен для изучения больших и гибких структур, таких как РНК и комплексы РНК-белок, которые трудно поддаются традиционным методам высокого разрешения, таким как ЯМР и рентгеновская кристаллография (4).Этот метод также можно использовать для получения более подробной информации о структуре и динамике, например, путем объединения измерений FRET одиночных молекул с подробным анализом и моделированием (5).

На сегодняшний день внешние хромофоры с (предположительно) случайной ориентацией использовались в большинстве исследований FRET для исследования совместной локализации и расстояний, что означает, что используется только зависимость от расстояния. Например, индуцированное ионами сворачивание изгибов в РНК было исследовано с использованием мечения концов флуоресцеином и Cy3 (6).Одним из способов повышения уровня информации, получаемой от FRET в системах РНК, могло бы быть использование аналогов флуоресцентных оснований, которые прочно расположены внутри нуклеиновой кислоты и, следовательно, сообщают как о расстоянии, так и об относительной ориентации между донором и акцептором. Было показано, что это позволяет с высокой точностью исследовать структурные изменения в ДНК (7,8). До настоящего времени сообщалось об ограниченном количестве FBA для РНК, например tC ^O (9), тиено [3,4- d ] пиримидины (^th A, ^th C, ^th G и ^th U) (10) и изотиазоло [4,3 — d ] пиримидинов (^tz A, ^tz C, ^tz G и ^tz U) (11), суррогат U, применяемый в исследованиях связывания малых молекул РНК (12), аналог пиримидина для Исследования G-квадруплексов (13) и нуклеозидов расширенной РНК (кРНК) (14).Однако межосновный FRET был исследован только на ДНК с использованием либо неэмиссионного акцептора (FRET-пары tC ^O –tC _nitro (15), qAN1 – qA _nitro (8) и pA – qA _nitro). (16)) или эмиссионного акцептора (^th dG – tC) (17). Использование эмиссионного акцептора теоретически может обеспечить простое колориметрическое считывание и простой и полезный внутренний контроль эффективности FRET при условии, что полосы эмиссии донора и акцептора существенно разделены. Однако большинство FBA с высокой эмиссией излучают в довольно узком диапазоне длин волн (400–500 нм), и результирующее перекрытие эмиссии может добавить дополнительный уровень сложности и неопределенности к анализу FRET. Напротив, неэмиссионный акцептор позволяет количественно оценить эффективность FRET просто как уменьшение флуоресценции (или времени жизни) донора по сравнению с флуоресценцией одного донора, что значительно упрощает анализ данных и повышает точность.

Здесь мы сообщаем о первых исследованиях межосновного FRET в РНК с использованием пары FRET tC ^O –tC _nitro (Рисунок 1).Неэмиссионная акцепторная молекула tC _nitro синтезирована и впервые охарактеризована для использования в контексте РНК. В эталонном исследовании мы видим превосходное соответствие между наблюдаемыми и теоретически предсказанными значениями эффективности FRET для РНК А-формы без существенных признаков структурных нарушений по сравнению с дуплексом РНК естественной формы А, что указывает на то, что эту пару FRET можно использовать для исследования структурные изменения внутри РНК с высокой точностью. Более того, общее использование межосновного FRET для исследования структурных изменений в РНК продемонстрировано здесь с использованием конформационного изменения от A- к Z-форме.

Рисунок 1.

Структура эмиссионного донора FRET tC ^O и неэмиссионного акцептора FRET tC _nitro.

Рис. 1.

Структура эмиссионного донора FRET tC ^O и неэмиссионного акцептора FRET tC _nitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез и характеристика рибо-tC _нитро фосфорамидита представлены в дополнительных данных.Фосфорамидит рибо-tC ^O синтезирован согласно литературным данным (9). Твердофазный синтез олигорибонуклеотидов, модифицированных tC ^O / tC _нитро, и их характеристика описаны в дополнительных данных.

Все использованные образцы, если не указано иное, были приготовлены в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,4, с добавлением 100 мМ NaCl и 1 мМ EDTA. Все образцы были смешаны и обработаны в стерильной среде, свободной от РНКазы. Концентрацию олигонуклеотидов определяли путем измерения поглощения при 260 нм.Молярную поглощающую способность немодифицированных одиночных цепей олигонуклеотидов при 260 нм рассчитывали с использованием онлайн-анализатора олигонуклеотидов IDT (Integrated DNA Technologies; http://eu.idtdna.com/calc/analyzer). Молярная абсорбционная способность модифицированных цепей была рассчитана таким же образом с заменой модифицированного основания на цитозин и с поправкой на разницу молярной абсорбции между цитозином (ϵ = 7400 M ^-1 см ^-1) и tC ^O ( ϵ = 11000 M ⁻¹ см ⁻¹) или tC _nitro (ϵ = 9700 M ⁻¹ см ⁻¹) на длине волны 260 нм.

Гибридизация образцов РНК А-формы, используемых для УФ-плавления и кругового дихроизма, была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи с равным количеством акцепторной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагреванием до 95 ° C и, через 10 мин, охлаждение до 5 ° C при 7,5 ° C ч ^-1. Концентрация донорных нитей при отжиге составляла 4 мкМ. Образцы РНК в форме A – Z, используемые для УФ-плавления и кругового дихроизма, были приготовлены аналогичным образом, за исключением того, что каждую донорную цепь смешивали с 30% избытком ее комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и что концентрация доноров при отжиге составляла 5.08 мкМ.

Образцы для эталонного исследования A-РНК FRET были гибридизованы, как указано выше, с 30% -ным избытком его комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и концентрацией донорной цепи 2 мкМ во время отжига.

Гибридизация образцов для исследования FRET от A- до Z-РНК была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи со 100% избытком ее комплементарной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагревом до 75 ° C и, через 10 мин, охлаждением. до 55 ° C при 1,7 ° C h ^-1 с последующим охлаждением до 5 ° C при 60 ° C h ^-1.Концентрация донорной нити во время отжига составляла 20 мкМ (была выбрана более высокая концентрация, чтобы способствовать гетеродуплексному отжигу по сравнению с самоотжигом в шпильки).

Все образцы, использованные для измерения РНК A-формы, были впоследствии разбавлены до 2 мкМ фосфатным буфером, тогда как образцы Z-формы были разбавлены фосфатным буфером и достаточным количеством NaClO ₄ · H ₂ O (Sigma-Aldrich) для получения результата. в желаемой концентрации NaClO ₄ (8 M, если не указано иное), принимая во внимание результирующее изменение плотности раствора (18), а также корректируя разницу в концентрации образца (определяется по поглощению при 260 нм) .

Все образцы были измерены сразу после отжига или хранились при -20 ° C между измерениями.

РНК УФ-плавление и круговой дихроизм

Кривые плавления

РНК в УФ-диапазоне регистрировали на приборе Cary 4000 (Varian Technologies) с программируемым блоком температуры, состоящим из нескольких ячеек, путем нагревания от 20 ° C до 90 ° C и последующего охлаждения до 20 ° C со скоростью 0,5 ° C мин. ^-1. Поглощение при 260 нм регистрировали каждые 0,5 ° C в течение двух циклов. Концентрация дуплекса во всех измерениях составляла 2 мкМ.Температуры плавления рассчитывались как максимум первой производной кривых плавления в УФ-диапазоне после сглаживания с помощью FFT-фильтрации.

Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировали на спектрометре КД Chirascan (Applied Photophysics), сканирование которого составляло от 200 до 600 нм, с использованием времени интегрирования 0,5 с и трех повторов. Концентрация дуплекса составляла 2 мкМ, и все спектры корректировали на фоновый вклад.

Измерения флуоресценции

Спектры стационарного излучения регистрировали на SPEX Fluorolog 3 (Jobin Yvon Horiba) с длиной волны возбуждения 377 нм.Концентрация дуплекса во всех образцах составляла 2 мкМ в установившемся режиме и при измерении срока службы. Эмиссия регистрировалась между 385 и 745 нм при скорости сканирования 600 нм мин ^-1.

Квантовые выходы были измерены для дуплексов только с tC ^O (т.е. без tC _nitro) с длиной волны возбуждения 356 нм с использованием сульфата хинина (Φ _f = 54,6%) в 0,5 MH ₂ SO ₄ в качестве справки. Эмиссия регистрировалась между 360 и 690 нм при скорости сканирования 600 нм мин. ^-1.

Время жизни флуоресценции определяли с помощью коррелированного по времени счета одиночных фотонов (TCSPC). Образцы возбуждали импульсным лазерным диодом PicoQuant (10 МГц), излучающим на длине волны 377 нм, а эмиссионный монохроматор был установлен на 460 нм. Подсчет проводился с помощью фотоумножителя с микроканальной пластиной R3809U-50 (Hamamatsu) и вводился в многоканальный анализатор Lifespec (Edinburgh Analytical Instruments) с 2048 каналами. Условие остановки было установлено на 10 000 отсчетов в верхнем канале. Реконволюционная аппроксимация для двух- или трехэкспоненциальных функций была выполнена с помощью Fluofit Pro v.

4 (PicoQuant GmbH). Среднее время жизни было взвешено по амплитуде в соответствии с уравнением (1):

$$ \ begin {уравнение *} \ langle \ tau \ rangle = \ frac {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i} {\ tau _i}} } {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i}}} \ end {формула *} $$

(1) где | $ \ langle \ tau \ rangle $ | — среднее время жизни, | $ {\ tau _i} $ | — i -е время жизни и | $ {\ alpha _i} $ | — амплитуда i -го времени жизни. Измерения были продублированы. Эффективность FRET рассчитывалась исходя из времени жизни стационарного излучения и флуоресценции в соответствии с уравнениями (2 и 3):

$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{I _ {{\ rm DA }}}}} {{{I _ {\ rm D}}}} \ end {уравнение *} $$

(2)

$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{\ tau _ {{\ rm DA}}}}} {{{\ tau _ {\ rm D}}}} \ end {формула *} $$

(3) где I — интегральная интенсивность донора, а τ — среднее время жизни донора.6}} \ end {формула *} $$

(5) где η — показатель преломления среды (1,4 для биомолекул), Φ _D — квантовый выход донора, Дж ( λ ) — интеграл перекрытия, R _DA — расстояние между донором и акцептором, а κ ² — коэффициент ориентации, описывающий относительную ориентацию дипольных моментов перехода донора и акцептора.

Зная фотофизические свойства пары FRET (Φ _D и J ( λ )), а также взаимное положение и ориентацию донора и акцептора ( R _DA и κ ²), Ожидаемая эффективность переноса рассчитывалась с помощью программы FRETmatrix на основе MATLAB (19).Протокол немного отличался для A- и Z-формы РНК (рис. 2A), как описано ниже.

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот. Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот.Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

А-форма

Средние базовые параметры шага для A-формы были взяты из Olson et al. (21) На рис. 2В показаны шесть различных параметров основного шага, которые используются для построения моделей нуклеиновых кислот. Чтобы создать плавную кривую, направляющую взгляд, каждый базовый шаг был разделен на 10 шагов одинакового размера, для которых было вычислено гипотетическое значение FRET. В расчетах использовалась ориентация дипольных моментов перехода tC ^O и tC _nitro (22,23), а также экспериментально наблюдаемый квантовый выход tC ^O в контексте каждой последовательности: 19.1% для эталонного исследования A-РНК и 20,9% для исследования A- в Z-РНК (дополнительные таблицы S4 и S8). Используя уравнение (6), интеграл перекрытия, J _DA, был экспериментально определен как 1,7 × 10 ¹⁴ нм ⁴ M ⁻¹ см ⁻¹ для эталонного исследования A-RNA и 1,5 × 10 ¹⁴ нм ⁴ M ^-1 см ^-1 для A-формы РНК в исследовании A- в Z-РНК.

$$ \ begin {уравнение *} {J _ {{\ rm {DA}}}} = \ smallint {I _ {\ rm {D}}} \ left (\ lambda \ right) {\ varepsilon _ {\ rm { A}}} \ left (\ lambda \ right) {\ lambda ^ {\ rm {4}}} {\ rm {d}} \ lambda \ end {формула *} $$

(6) где I _D — это зависящий от длины волны спектр излучения донора, нормированный для интегрирования к единице, _A — зависящая от длины волны молярная поглощающая способность акцептора, а λ — длина волны в нм.

Z-образная форма

Для обеспечения возможности сравнения между тремя ранее описанными Z-образными структурами (1T4X, 2GBX и 1QBJ), которые являются 6-мерными, и нашей структурой, которая представляет собой 14-мерную структуру, мы использовали метод, в котором мы расширили 6меров ранее описанных PDB- файлы на 14меров с использованием усредненных параметров базового шага. PDB-файлы сначала были проанализированы с помощью Web 3DNA, чтобы получить параметры базового шага для каждой структуры (24). Каждый параметр был усреднен для создания усредненных параметров базового шага GC и CG для конкретной структуры.Используя эти параметры, для каждой структуры был создан новый файл базовых шагов, содержащий 14 вместо исходных 6 базовых пар. Наконец, используя эти базовые файлы, стандартные геометрии пар оснований Уотсона-Крика, квантовый выход tC ^O в Z-РНК (Φ _f = 21,3%) и спектральное перекрытие между излучением tC ^O и абсорбция tC _nitro в Z-РНК ( J _DA = 1,4 × 10 ¹⁴ нм ⁴ M ^-1 см ^-1), теоретическая эффективность FRET при различных разделениях для каждой структуры рассчитывались с помощью FRETmatrix (19).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез tC

_нитро

Недавно мы сообщили о синтезе и включении в РНК tC ^O -рибонуклеозида и пришли к выводу, что рибо-tC ^O сохраняет дуплекс A-формы, поддерживает высокий квантовый выход независимо от контекста последовательности и, следовательно, является отличным FRET кандидат в доноры для межосновного FRET в РНК (9). В данной работе мы сообщаем о синтезе неэмиссионного акцептора FRET tC _нитро -рибонуклеозида и его фосфорамидитного субстрата 5 (схема 1).2′-O-TBS-защищенный рибонуклеозид tC _nitro ( 4 , схема 1) был синтезирован в многограммовой шкале по пятиэтапному протоколу. Силильная защитная группа соединения 1 , включая защиту 2′-OH TBS, необходимую для конечного строительного блока, была введена на первом этапе на основе ранее опубликованной методологии (25). Затем соединение 1 было подвергнуто кросс-сочетанию CS-катализатора с тиолом 2 , что позволило селективно образовывать связь CS при сохранении защитных групп и стереохимии нуклеозидного фрагмента с получением соединения 3 в 81% доходность.Трициклическая ароматическая система tC _nitro была сконструирована с конденсацией с замыканием цикла, для которой PyBOP оказался уникально активным. В мягких условиях продукт внутримолекулярной конденсации был получен с высокой селективностью по межмолекулярной реакции. С полученного полностью защищенного рибонуклеозида tC _нитро впоследствии снимали защиту с получением соединения 4 . Две стандартные стадии защиты (26,27) дали желаемый строительный блок tC _нитро -фосфорамидита 5 для включения олигорибонуклеотида.

Схема 1.

Синтез tC _нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu ₂ Si (OTf) ₂, DMF, 0 ° C, 1 ч; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃, ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч.( E ) Py · (HF) _x, CH ₂ Cl ₂, 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.

Схема 1.

Синтез tC _нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu ₂ Si (OTf) ₂, DMF, 0 ° C, 1 ч; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃, ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч. ( E ) Py · (HF) _x, CH ₂ Cl ₂, 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.

Тест FRET А-формы РНК

Для изучения FRET в РНК с использованием tC ^O и tC _nitro, мы синтезировали три донорные последовательности, содержащие tC ^O, и четыре комплементарных акцепторных последовательности, содержащие tC _nitro (Рисунок 3A), а также их немодифицированные аналоги, названные D0 и A0 соответственно.Эти нити позволяют формировать дуплексы с 2–13 п.н., разделяющими донор и акцептор. Спектры КД дуплексов, модифицированных tC _nitro, очень похожи на спектры соответствующего немодифицированного дуплекса, что указывает на то, что tC _nitro не нарушает A-форму (дополнительный рисунок S1). Кроме того, свойства УФ-плавления дуплексов, модифицированных tC _nitro, показывают, что tC _nitro, как и tC ^O, оказывает немного стабилизирующее действие на A-форму РНК, причем степень стабилизации зависит от ближайших соседей (1 . 4–1,7 ° C для 5′-C tC _nitro U-3 ‘; 3,9–4,2 ° C для 5’-U tC _nitro C-3 ‘; Дополнительная таблица S1) (9).

Рисунок 3. Последовательности

( A ) РНК, используемые для исследования характеристик межосновного FRET в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC ^O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC _nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донор-содержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазовые сайты обозначены нижним подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, используемых в этом исследовании, см. В дополнительных таблицах S1 и S7.

Рисунок 3. Последовательности

Флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro в A-форме РНК приведены в таблице 1. Важно отметить, что tC ^O сохраняет высокий и стабильный квантовый выход флуоресценции независимо от контекста последовательности (9), а также представляет собой отличное перекрытие между длинноволновой полосой излучения tC ^O и полосой поглощения tC _nitro (Рисунок 4). Предполагая свободное вращение дипольных моментов перехода (κ ² = 2/3), теоретическое расстояние Ферстера для пары tC ^O –tC _nitro FRET в РНК составляет 28 Å, что соответствует почти одному полному витку спираль А-формы РНК.

Таблица 1.

Абсорбционные и флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

Белковая пара	Максимум возбуждения донора (нм)	Максимум эмиссии акцептора (нм)	Квантовый выход донора	Коэффициент молярной экстинкции акцептора	Яркость фёрстера
EBFP2-mEGFP	383	507	0.56	57,500	4,8	1: 2
ECFP-EYFP	440	527	0,40	83,400	4,9	1: 4		9040u			528	0,62	92,200	5,4	1: 2
MiCy-mKO	472	559	0,90	51,600							492	528	0. 85	92,200	5,1	1: 1
CyPet-YPet	477	530	0,51	104,000	5,1	1: 4,5								610	0.60	72,000	5,1	2,5: 1
Venus-mCherry	528	610	0,57	72,000					9060 5,7	528	581	0.57	138,000	5,9	1: 2
Venus-mPlum	528	649	0,57	41,000	5,2	13: 1	13: 1

.	λ _{абс., Макс.} [нм] .	ϵ _макс [M ⁻¹ см ⁻¹] .	λ _{em, макс.} [нм] .	Φ _f [%] .	〈τ〉 [нс] .
tC ^Oa	368–373 (370)	7400–9700 (8300)	452–460 (456)	20–25 (22)	3,8–4,7 (4,3)
tC _нитро ^b	449–458 (454)	6400–7100 (6800)	–	—

λ _{абс., Макс.} [нм] .	ϵ _макс [M ⁻¹ см ⁻¹] .	λ _{em, макс.} [нм] .	Φ _f [%] .	〈τ〉 [нс] .
tC ^Oa	368–373 (370)	7400–9700 (8300)	452–460 (456)	20–25 (22)	3.8–4.7 (4,3)
tC _nitro ^b	449–458 (454)	6400–7100 (6800)	—	—

Стол поглощающий флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

.	λ _{абс., Макс.} [нм] .	ϵ _макс [M ⁻¹ см ⁻¹] .	λ _{em, макс.} [нм] .	Φ _f [%] .	〈τ〉 [нс] .
tC ^Oa	368–373 (370)	7400–9700 (8300)	452–460 (456)	20–25 (22)	3,8–4,7 (4,3)
tC _нитро ^b	449–458 (454)	6400–7100 (6800)	–	—

λ _{абс., Макс.} [нм] .	ϵ _макс [M ⁻¹ см ⁻¹] .	λ _{em, макс.} [нм] .	Φ _f [%] .	〈τ〉 [нс] .
tC ^Oa	368–373 (370)	7400–9700 (8300)	452–460 (456)	20–25 (22)	3.8–4.7 (4,3)
tC _нитро ^b	449–458 (454)	6400–7100 (6800)	—	—

Рис. 4.

Спектральное перекрытие между испусканием tC ^O и поглощением tC _nitro в А-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺.

Рис. 4.

Для исследования применимости межосновного FRET с использованием tC ^O и tC _nitro в системах РНК, измеренная эффективность FRET сравнивалась с теоретическим значением для РНК A-формы, которое было рассчитано на основе установленной структуры РНК и свойств зонда.Для сравнения также были рассчитаны теоретические значения на основе B-формы РНК. В этом исследовании эффективность FRET как функция расстояния донор-акцептор измерялась с использованием измерений как стационарного излучения, так и времени жизни флуоресценции tC ^O в дуплексах с tC _nitro и без него (дополнительные таблицы S2 и S3; дополнительный рисунок S2). На рис. 5 показана средняя эффективность переноса этих двух методов вместе с теоретической эффективностью FRET для tC ^O –tC _nitro внутри статической A-формы и B-формы нуклеиновой кислоты.Пунктирные кривые, показывающие эффективность переноса даже при неестественном нецелочисленном разделении, добавлены к рисунку, чтобы направлять взгляд. Локальные минимумы этих кривых происходят от разделений, где диполи перехода донора и акцептора будут перпендикулярны друг другу и, следовательно, составляют геометрию, в которой передача энергии не может происходить в этом статическом теоретическом представлении структуры нуклеиновой кислоты.

Рисунок 5.

Эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro в A-форме РНК как функция разделения пар оснований.Голубые ромбики отмечают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение срока службы. Черные ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри РНК А-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7.4, 123 мМ Na ⁺.

Рис. 5.

Эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro в А-форме РНК как функция разделения пар оснований. Голубые ромбики отмечают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение срока службы. Черные ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри РНК А-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺.

Измеренные данные точно соответствуют предсказанному паттерну FRET А-формы, показывая, что аналоги оснований прочно укладываются внутри РНК, и убедительно предполагая, что они не вызывают значительного возмущения структуры РНК. Следовательно, это эталонное исследование показывает, что пара tC ^O – tC _nitro FRET отлично подходит для измерения межосновного FRET в РНК, особенно при разделении 4–12 п.н. Ранее мы показали, как связывание нетропсина с ДНК и переход от B к Z в ДНК можно изучить с помощью межосновного FRET (7,8).Поскольку фотофизические свойства tC ^O и tC _nitro хорошо известны (см. Таблицу 1 выше), аналогичные исследования внутри РНК теперь станут возможными, что делает межосновной FRET с использованием tC ^O –tC _nitro мощным дополнением к существующие методы изучения структуры РНК, конформационных изменений и динамики.

Форма от A до Z FRET

Чтобы проиллюстрировать возможности этого метода, мы разработали исследование, в котором tC ^O –tC _нитро interbase FRET применяли для исследования конформационных изменений в РНК, в данном случае перехода от A- к Z-РНК.Структура правой B-формы ДНК и A-формы РНК хорошо изучена. Однако и ДНК, и РНК также могут принимать левую структуру, называемую Z-формой. Z-форма ДНК была впервые кристаллизована и охарактеризована с помощью рентгеновской кристаллографии в 1979 г. (28), тогда как первая левосторонняя структура РНК была описана в 1984 г. (29). Как и в случае с Z-формой ДНК, переход от A- к Z-форме РНК происходит предпочтительно в чередующихся GC-повторах, но для индукции трансформации необходимы более экстремальные солевые условия.Биологическая роль Z-формы РНК все еще неясна, но окрашивание антителами к Z-РНК указывает на ее присутствие в цитоплазме и ядрышке (30), а некоторые белки интерферонового ответа имеют домены, которые могут стабилизировать Z-форму РНК (31). Однако не хватает инструментов, которые могли бы отслеживать структурные изменения Z-РНК в системах живых клеток, а структурные исследования Z-РНК немногочисленны; только две 6-мерные структуры были представлены в базе данных PDB: исследование ЯМР, где Z-форма индуцируется высокой концентрацией соли (6 M NaClO ₄, PDB ID: 1T4X), и кристаллографическое исследование Z-формы РНК вместе с фермент ADAR1 (PDB ID: 2GXB) (31,32).

Чтобы сравнить структуры, депонированные в PDB, и структуры, использованные в данном исследовании, мы применили теорию FRET для прогнозирования паттернов FRET, ожидаемых от tC ^O –tC _nitro при вставке в разные положения в два олигорибонуклеотида, каждый с структура, соответствующая одной из упомянутых выше записей PDB (рисунок 6A). Поскольку некоторые исследования указывают на сильное сходство между Z-формой ДНК и РНК, теоретический паттерн FRET, полученный с использованием структуры Z-формы ДНК, связанной с ADAR1 (PDB ID: 1QBJ), был включен в качестве дополнительного сравнения (31,33). Как видно на рисунке 6A, теоретический паттерн FRET для трех указанных структур демонстрирует общее сходство, но также и значительные различия из-за структурных различий между ними. Поскольку Z-форма в основном встречается в GC-повторах, наши аналоги цитозина предоставляют прекрасную возможность изучить конформационные изменения от A- к Z-форме РНК. Наша цель в этом исследовании РНК из A- в Z-формы была двоякой: во-первых, установить, можно ли использовать FRET между основаниями для исследования перехода РНК из A- в Z.Это конформационное изменение обычно контролируется с помощью CD, для чего требуются приборы, которые реже используются в научно-исследовательских лабораториях, значительно большее количество образцов, чем при измерениях флуоресценции, и несовместимо с измерениями в целлюлозе . Во-вторых, чтобы получить новую структурную информацию о Z-РНК и поместить ее в контекст ранее определенных структур Z-РНК.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее сообщенных структур Z-формы : Записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO ₄), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z -форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33). ( B ) Измерена эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переключении с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO ₄ (Z-форма) и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение срока службы.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-repeat в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее сообщенной Z-формы структуры: записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO ₄), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z-форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33). ( B ) Измерена эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переключении с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO ₄ (Z-форма) и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение срока службы.

Последовательности с GC-повторами очень склонны к самодимеризации и образованию шпилек, и поэтому требуют другого и более тщательного дизайна последовательности по сравнению с нашим первоначальным эталонным исследованием (рис. 3A).Чтобы уменьшить помехи от образования шпильки, GC-повтор был сохранен как можно короче (14-мерный), но при этом позволял исследовать полный виток спирали, то есть донорно-акцепторное разделение до 10 п.н., без истирания концов. Кроме того, GC-повтор фланкирован одним базовым сайтом и восемью основаниями с каждой стороны. Восемь фланкирующих оснований были введены, чтобы удерживать концы вместе в А-форме на протяжении всего эксперимента и для повышения стабильности согласованного дуплекса в рамке считывания, тогда как базовые сайты служат в качестве гибкого линкера, позволяющего формировать GC-повтор. Z-РНК, пока концы остаются в А-форме.

Для этого исследования использовали 8 M NaClO ₄ для индукции Z-формы. Исследования CD показывают, что Z-форма стабильна при комнатной температуре в течение> 18 часов в этих условиях и что донор и акцептор не препятствуют ее образованию (дополнительный рисунок S3), что является дополнительным признаком того, что модифицированные основания РНК служат хорошими аналогами их естественные аналоги цитозина. Чтобы исследовать разницу между FRET в A- и Z-форме РНК, измерения с использованием времени жизни как стационарной эмиссии, так и флуоресценции были выполнены для обеих конформаций (Рисунок 6B, дополнительный рисунок S4 и дополнительные таблицы S5 и S6). Поскольку донор и акцептор в последовательностях GC находятся в одной цепи для нечетных разделений и в противоположных цепях для четных разделений, FRET-паттерн GC-повтора в A-форме отличается от эталонного исследования, в котором донор и акцептор являются в противоположных прядях для всех разделений (дополнительный рисунок S5). В данных Z-формы есть расхождение между эффективностями FRET в установившемся режиме и на основе срока службы для седьмого и девятого разделений (дополнительная таблица S7). Эти два разделения были измерены с использованием последовательностей, меченных одной и той же цепью, где образование шпильки может сблизить донор и акцептор в пространстве (0–2 п.н.).На таких коротких расстояниях тушение доноров может иметь непосредственный контакт (например, перенос электронов по Декстеру) и, следовательно, происходить во временном масштабе, который невозможно разрешить с помощью нашей настройки времени жизни флуоресценции. В таких условиях только время жизни правильно свернутой фракции образца, то есть дуплексов Z-формы РНК, будет видно в затухании флуоресценции, в то время как стационарное излучение будет дополнительно подавляться и, следовательно, приведет к кажущемуся более высокому FRET ценить. Поскольку наши результаты показывают разницу между установившимся режимом FRET и FRET на протяжении всей жизни на седьмом и девятом разделении и, следовательно, указывают на частичное образование «темных частиц» (например,грамм. шпильки) в этих образцах, для этих точек данных в последующей оценке использовались только значения эффективности FRET на основе срока службы (рисунок 6).

Во-первых, мы исследовали, можно ли использовать FRET между основаниями РНК для исследования перехода РНК от A- к Z. Разница в паттерне FRET между A- и Z-формами РНК поразительна, с изменением эффективности переноса на 25% -87% для семи из восьми исследованных разделений (рис. 6B), что указывает на то, что система достаточно чувствительна для изучения изменений между РНК в A- и Z-форме путем отслеживания изменения FRET только при одном или нескольких разделениях.Квантовый выход tC ^O по существу одинаков в обеих конформациях (дополнительная таблица S8), что убедительно свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения в эффективности переноса обусловлены структурными изменениями в РНК, а не вариациями в микроокружении зонда. Взятые вместе, это показывает, что межосновная РНК FRET между tC ^O и tC _nitro, разделенными 4–10 п.н., может исследовать структурные изменения A- в Z-РНК с высокой чувствительностью, что дополнительно иллюстрирует общую адаптируемость этого метода для исследование структурных изменений нуклеиновых кислот.Существенные различия в продолжительности жизни флуоресценции между соответствующими дуплексами РНК A- и Z-формы указывают на возможные применения микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), в которой РНК, специфически в Z-форме, может контролироваться с помощью микроскопии живых клеток.

Во-вторых, мы сравнили наши данные FRET с теоретически полученным паттерном FRET из нескольких существующих структур PDB. Паттерн FRET, который мы получили для Z-формы РНК, хорошо согласуется с паттернами ранее описанных структур на коротких и длинных расстояниях (рис. 6А).Однако на промежуточных расстояниях (6-8 п.н.) наблюдаемая эффективность FRET значительно ниже, чем значения, рассчитанные на основе известных средних параметров 6-мерных структур PDB. Одно из объяснений этих расхождений может заключаться в том, что структура Z-РНК отличается для ранее описанной короткой и по своей природе менее стабильной 6-членной РНК по сравнению с нашей 14-мерной системой, где концы удерживаются на месте фланкирующими основаниями РНК А-формы. Структуры 6-членной Z-РНК, определенные с помощью методов ЯМР или рентгеновских лучей, также могут немного отличаться от структуры в растворе при более физиологически значимых концентрациях РНК.Учитывая очень мало отчетов, содержащих структурную информацию для Z-формы РНК, слишком рано давать подробные комментарии о структурной однородности этой дуплексной формы РНК. Это потребует проведения большего количества сравнительных исследований, посвященных таким аспектам, как длина олигорибонуклеотида и тип связывающего белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что пара tC ^O – tC _nitro FRET хорошо подходит для мониторинга межосновного FRET в дуплексах РНК. Зонды прочно расположены внутри РНК, и паттерн FRET точно соответствует предсказанным значениям для A-РНК. Мы наблюдаем большое изменение эффективности FRET, поскольку Z-РНК образуется из A-формы с использованием высокой концентрации NaClO ₄, что показывает, что, как и в ДНК, межосновная РНК FRET может использоваться для исследования структурных изменений в физиологических условиях. с высокой чувствительностью, а также универсальностью в отношении шага tC ^O –tC _nitro. При сравнении нашего измеренного паттерна FRET с несколькими существующими структурами PDB Z-формы РНК, мы обнаруживаем общие сходства, но также и существенные различия.Сходные по величине различия также могут быть обнаружены между структурами PDB, подразумевая, что необходимо исследовать больше структур Z-РНК, чтобы определить, имеет ли РНК Z-формы одну однородную структуру с уникальным набором параметров для извлечения. Принимая во внимание более высокое структурное разнообразие и динамику РНК и комплексов РНК-белок по сравнению с ДНК, это представляет собой значительный шаг вперед не только для межосновного FRET как общей методологии нуклеиновых кислот, но, что важно, для быстрорастущей области структуры и динамики РНК. исследования в частности и исследования РНК в целом.В отличие от большинства методов исследования структуры и динамики, межбазовый FRET может выполняться в физиологических условиях. Следовательно, мы предполагаем, что основная полезность этого метода заключается в мониторинге структурных изменений РНК в системах живых клеток, либо отдельно, либо в гибридных подходах вместе с рентгеновскими лучами или ЯМР, для выявления ценной новой информации об основных молекулах жизни, РНК. .

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Афаф Х. Эль-Сагира и профессора Тома Брауна (Оксфордский университет, Великобритания) за обучение A.F.F. и М. в очистке РНК.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Шведский фонд стратегических исследований [SSF, IS14-0041, IRC15-0065 до L. M.W., ID14-0036 до M.G.]; Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707 к L.M.W.]. Финансирование платы за открытый доступ: Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707].

Заявление о конфликте интересов .Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

Dethoff

E.A.

Chugh

Mustoe

A.M.

Аль-Хашими

Х.М.

Функциональная сложность и регуляция через динамику РНК

Природа

2012

;

482

322

—

330

.2.

Harpur

A.G.

Wouters

F.S.

Bastiaens

P.I.H.

Визуализация FRET между спектрально подобными молекулами GFP в отдельных ячейках

Nat. Biotechnol.

2001

;

167

—

169

.3.

Hillger

Hanni

Nettels

Geister

Grandin

Textor

M. Шулер

Б.

Исследование взаимодействий белок-шаперон с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул

Angew. Chem. Int. Эд.

2008

;

6184

—

6188

.4.

Губаев

Klostermeier

Hammann

Структура и складывание РНК: биофизические методы 9000 и прогнозирование.

2013

;

Берлин

Де Грюйтер

181

—

214

.5.

Peulen

T.O.

Опанасюк

Seidel

C.A.M.

Сочетание графических и аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа измерений FRET меченых макромолекул с временным разрешением

J. Phys. Chem. В

2017

;

121

8211

—

8241

.6.

McPhee

S.A.

Huang

Lilley

D. M.

Критическая пара оснований в k витках, которая придает характеристики сворачивания и коррелирует с биологической функцией

Nat. Commun.

2014

;

5127

.7.

Dumat

Larsen

A.F.

Wilhelmsson

L.M.

Изучение переходов Z-ДНК и B- в Z-ДНК с использованием аналога цитозина FRET-пары

Nucleic Acids Res.

2016

;

e101

.8.

Wranne

M.S.

Füchtbauer

Dumat

Bood

El-Sagheer

Brown

, H.

Grøtli

Wilhelmsson

На пути к полной гибкости последовательности аналога основания нуклеиновой кислоты FRET

J. Am. Chem. Soc.

2017

;

139

9271

—

9280

.9.

Füchtbauer

A.F.

Preus

Börjesson

McPhee

S.A.

Lilley

D.M.

Wilhelmsson

L.M.

Флуоресцентный аналог цитозина РНК — внутренний зонд для детальных исследований структуры и динамики

Sci. Отчет

2017

;

2393

.10.

Shin

Sinkeldam

R.W.

Tor

Эмиссионный алфавит РНК

J. Am. Chem. Soc.

2011

;

133

14912

—

14915

.11.

Ровира

А.Р.

Fin

Tor

Химический мутагенез алфавита эмиссионной РНК

J. Am. Chem. Soc.

2015

;

137

14602

—

14605

.12.

Xie

Dix

A.V.

Tor

FRET позволяет в реальном времени обнаруживать связывание малых молекул РНК

J. Am. Chem. Soc.

2009

;

131

17605

—

17614

13.

Tanpure

A.A.

Srivatsan

S.G.

Конформационно-чувствительные аналоги нуклеозидов в качестве зондов включения флуоресценции, специфичных для топологии, для G-квадруплексов ДНК и РНК

Nucleic Acids Res.

2015

;

e149

.14.

Эрнандес

A.R.

Kool

E.T.

Компоненты xRNA: Синтез и флуоресценция полного генетического набора рибонуклеозидов с увеличенным размером

Org. Lett.

2011

;

676

—

679

. 15.

Börjesson

Preus

El-Sagheer

A.H.

Brown

Albinsson

Wilhelmsson

L.M.

Аналог основания нуклеиновой кислоты FRET-Pair, облегчающий подробные структурные измерения в системах, содержащих нуклеиновые кислоты

J. Am. Chem. Soc.

2009

;

131

4288

—

4293

16.

Bood

Füchtbauer

A.F.

Wranne

M.S.

J.J.

Sarangamath

El-Sagheer

A.H.

Rupért

D.L.M.

Fisher

R.S.

Magennis

S.W.

Джонс

A.C.

et al. .

Пентациклический аденин: универсальный и исключительно яркий флуоресцентный аналог основания ДНК

Chem. Sci.

2018

;

3494

—

3502

.17.

Хан

J.H.

Yamamoto

Park

Sugiyama

Разработка системы Vivid FRET на основе высокоэмиссионной аналоговой пары dG-dC

Chem. Евро. J.

2017

;

7607

—

7613

. 18.

Миллер

M.L.

Doran

Концентрированные солевые растворы.II. Вязкость и плотность тиоцианата натрия, перхлората натрия и йодида натрия

J. Phys. Chem.

1956

;

186

—

189

,19.

Preus

Kilså

Miannay

Albinsson

Wilhelmsson

метод моделирования и общего анализа FR FRET в нуклеиновых кислотах

Nucleic Acids Res.

2013

;

e18

.20.

Лю

X.J.

Олсон

W.K.

3DNA: программный пакет для анализа, восстановления и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

Nucleic Acids Res.

2003

;

5108

—

5121

. 21.

Олсон

W.K.

Бансал

М.

Берли

S.K.

Дикерсон

R.E.

Gerstein

Harvey

S.C.

Heinemann

X.J.

Neidle

Shakked

et al. .

Стандартная система координат для описания геометрии пар нуклеиновых кислот

J. Mol. Биол.

2001

;

313

229

—

237

.22.

Sandin

Börjesson

Mårtensson

Brown

Wilhelm2

Albinsson

Характеристика и использование беспрецедентно яркого и структурно не возмущающего аналога флуоресцентного основания ДНК

Nucleic Acids Res.

2008

;

157

—

167

.23.

Preus

Börjesson

Kilså

Albinsson

Wilhelmsson 9 acceptor

FR LM

_нитро

J. Phys. Chem. Б.

2010

;

114

1050

—

1056

. 24.

Zheng

G.H.

Лю

X.J.

Olson

W.K.

Web 3DNA — веб-сервер для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

Nucleic Acids Res.

2009

;

W240

—

W246

. 25.

Серебряный

В.

Бейгельман

Л.

Эффективный препарат защищенных рибонуклеозидов для синтеза фосфорамидитной РНК

Tetrahedron Lett.

2002

;

1983

—

1985

.26.

Sinha

Biernat

McManus

Köster

Полимерная подложка, олигонуклеотидный синтез 9 -000C5000 β-N9000, 9-000, β-N, 9000, XV4, 9000, β-N0005 , N -Диалкиламино- / N -Морфолинофосфорамидит дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающих снятие защиты и выделение конечного продукта

Nucleic Acids Res.

1984

;

4539

—

4557

. 27.

Ishizuka

Kimura

Komiyama

U-Tetrad стабилизирует структуру теломерной РНК человека 9000 G -8.

J. Am. Chem. Soc.

2010

;

132

7231

—

7233

. 28.

Ван

А.H.J.

Quigley

G.J.

Kolpak

F.J.

Crawford

J.L.

Vanboom

J.H.

Vandermarel

Rich

Молекулярная структура левостороннего двухспирального фрагмента ДНК при атомном разрешении

Природа

1979

;

282

680

—

686

,29.

Холл

К.

Cruz

Tinoco

Jovin

T.M.

Vandesande

J.H.

Z-РНК — двойная спираль левой РНК

Природа

1984

;

311

584

—

586

. 30.

Зарлинг

Д.А.

Calhoun

C.J.

Feuerstein

B.G.

Сена

E.P.

Цитоплазматическая микроинъекция иммуноглобулина Gs, распознающего спирали РНК, подавляет рост клеток человека

J. Mol. Биол.

1990

;

211

147

—

160

. 31.

Placido

Коричневый

B.A.

Lowenhaupt

Rich

Athanasiadis

Левосторонняя двойная спираль РНК, связанная Z-альфа-доменом редактирующего РНК фермента ADAR1

Структура

2007

;

395

—

404

.32.

Popenda

Milecki

Adamiak

R.W.

Структура высокосолевого раствора двойной спирали левой РНК

Nucleic Acids Res.

2004

;

4044

—

4054

. 33.

Schwartz

Rould

M.A.

Lowenhaupt

Herbert

Rich

Кристаллическая структура Z-альфа-домена редактирующего фермента человека ADAR1, связанного с левой Z-ДНК

Наука

1999

;

284

1841

—

1845

Заметки автора

Интернет-кампус ZEISS Microscopy | FRET-микроскопия со спектральной визуализацией

Введение

Сложная ассоциация между белками и путями передачи сигналов, которые контролируют клеточную функцию, зависят от множества слабых и временных динамических взаимодействий, которые часто трудно или даже невозможно охарактеризовать с помощью традиционной биохимической методологии. Флуоресцентная микроскопия продемонстрировала превосходную чувствительность при обнаружении чрезвычайно низких концентраций меченых биомолекул в очень широких пространственных и временных измерениях.С появлением и разработкой высокоэффективных генетически кодируемых флуоресцентных белков, которые могут стабильно экспрессироваться в живых клетках, несколько методов флуоресценции стали мощными инструментами для визуализации динамических взаимодействий между белками in situ, в физиологических условиях. В частности, применение метода резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) становится все более популярным, чтобы служить в качестве молекулярной линейки при определении межмолекулярных расстояний или для демонстрации того, образуются ли молекулярные комплексы.Для конструирования биомолекул, потенциально способных к взаимодействию FRET, можно использовать простые методы молекулярной биологии для слияния кДНК, кодирующей флуоресцентные белки, с белками-мишенями, которые, как предполагается, участвуют. В настоящее время предпочтительными флуоресцентными белками для анализа FRET являются производные GFP медузы Aequorea victoria с голубой и желтой эмиссией (ECFP и EYFP) в качестве доноров и рецепторов соответственно. Хотя ECFP и EYFP использовались в многочисленных исследованиях FRET, несколько более новых и продвинутых вариантов, Cerulean (производное голубого) и Citrine или Venus (желтые производные), оказались очень эффективными в обеспечении расширенного динамического диапазона, необходимого для внимательно отслеживайте чувствительные сигналы FRET. Кроме того, постоянное расширение цветовой палитры флуоресцентных белков предоставляет новых кандидатов в оранжевой, красной и дальней красной области спектра в качестве потенциальных партнеров FRET для существующих голубых, зеленых и желтых белков.

Среди наиболее полезных применений FRET в клеточной биологии — метод, который включает слияние двух флуоресцентных белков с концами экологически чувствительного белка или пептида, чтобы действовать как биосенсор специфических клеточных функций.Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков, способных к FRET, с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как кальциевая волна. индукция, эффекты циклических нуклеотидных мессенджеров, pH, флуктуации мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточных протеаз.Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. Рисунок 1). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков (в данном случае Cerulean и Venus), связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. Как правило, датчик демонстрирует очень сильный резонансный перенос энергии, который полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности. Поскольку метод обычно имеет высокий уровень динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами.Принципы резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET)

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении света флуорофором на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Максимумы (пики) спектрального профиля возбуждения и излучения отделены друг от друга переменной шириной полосы в диапазоне от десятков до сотен нанометров. Маркировка внутриклеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет локализовать их внутри фиксированных и живых препаратов.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. Используя этот метод, молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, оказываются совпадающими (и говорят, что они колокализуются). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна.В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли происходит взаимодействие между биомолекулами. FRET — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии (донор ) ко второму флуорофору (акцептор ) в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения FRET могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий.

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который способен передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения флуорофора в возбужденном состоянии как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся с той же частотой. Напротив, радиационная передача энергии (которая не происходит в FRET) требует испускания и последующего повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. . В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью событий, зависящих от растворителя, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции (от которой экспериментальная эффективность FRET можно извлечь).Если акцептор флуоресцентный, он будет излучать фотоны в соответствии со своим характерным спектральным профилем, таким образом производя измеримое ратиометрическое изменение сигнала. Большое отношение интенсивности акцептора к донору указывает на высокую эффективность FRET, которая также может быть приписана более короткому расстоянию или более благоприятной ориентации между флуорофорами. Эффективность процесса передачи энергии ( E _FRET ) изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора ( r ), как показано в уравнении, представленном ниже.Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными подходящим донорным и акцепторным флуорофором, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга. Таким образом, эффективность FRET математически можно описать как:

E _FRET = 1 / [1 + (r / R ₀) ⁶]

, где R ₀ (обычно называемый радиусом Ферстера) представляет собой характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов. В дополнение к требованию близости, эффективная передача энергии требует значительного перекрытия спектров донорного излучения и спектров поглощения акцептора (как показано на рисунке 2). Эффективность повышается за счет увеличения квантового выхода донора и / или коэффициента экстинкции акцептора. Например, квантовый выход ECFP составляет 0,40, тогда как выход Cerulean примерно на 50 процентов больше, что увеличивает эффективность FRET, когда Cerulean заменяется на ECFP в качестве донора FRET.Точно так же коэффициент экстинкции Венеры примерно на 11 процентов выше, чем у EYFP, что делает Венеру лучшим акцептором FRET. В общем, спектральное перекрытие между донором и акцептором должно быть достаточным для обеспечения радиуса Фёрстера, который составляет приблизительно 4 нанометра или более. Другой важный параметр, на который следует обратить внимание при выборе флуоресцентных белков в качестве пар FRET, — это соответствие относительной скорости созревания. Время, необходимое для созревания хромофора, колеблется от нескольких минут до многих часов, в зависимости от конкретного белка, и может широко варьироваться в пределах других близкородственных вариантов. Измерения FRET будут скомпрометированы в случаях, когда донорный флуоресцентный белок созревает значительно быстрее или медленнее, чем акцептор.

Для оптимизации измерений FRET необходимо учитывать множество других факторов. Одна из основных проблем — относительная яркость донорных и акцепторных флуорофоров. Как правило, из-за ограниченного динамического диапазона большинства микроскопов сопоставимые по яркости флуорофоры дают более удовлетворительные результаты. Значительное несоответствие яркости часто приводит к тому, что сигнал от одного флуорофора насыщает канал детектора, а сигнал от другого (диммера) флуорофора теряется в минимальном уровне шума.Другой часто встречающейся ловушкой является прямое возбуждение акцептора на длине волны, используемой для возбуждения донора, что приводит к избыточной эмиссии акцептора, которая не возникает в результате FRET. Этот артефакт упоминается как акцепторное спектральное просачивание . Кроме того, флуоресцентное излучение от донора может просачиваться в канал обнаружения акцептора (известный как донорское спектральное просачивание ), что также приводит к искусственно завышенным значениям FRET (рис. 2). В связи с тем, что эти источники проступания будут присутствовать практически во всех парах FRET, они неизбежно должны быть устранены во время измерений FRET.Флуоресцентные белки в анализе FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, которые идеально подходят для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки. Точно так же квантовые точки могут использоваться для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне плазматической мембраны, но эти зонды не могут проникнуть через мембрану и поэтому мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии, комплекс Гольджи. , или эндоплазматический ретикулум.Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время являются одними из лучших кандидатов на флуорофоры для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением. Однако многие из типичных артефактов, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от ширины полосы 30-40 нанометров на полувысоте ( FWHM ), характерной для спектральных профилей излучения многих синтетических красителей, во флуоресцентных белках они колеблются от приблизительно 60 нанометров до более 100 нанометров, что часто приводит к значительные области перекрытия при попытке разделить флуоресценцию донора и акцептора.Таким образом, широкие спектральные профили флуоресцентных белков ограничивают количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220-230 аминокислот, свернутый в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (так называемый бета--ствол; см. Рисунок 3) и состоящий из сильно связанных водородными связями бета — листы, которые окружают и защищают центральную альфа — спираль, содержащую остатки, образующие хромофор.Концы цилиндра закрыты полускиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов, воды и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET (рис. 3). Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентных белков пептидными остатками (на ограничивающем расстоянии близкого приближения от 2 до 3 нанометров), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET, которая может быть получена с флуоресцентными белками, примерно до 40 процентов от теоретическое значение.Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Проблемы, связанные со спектральной шириной полосы и размером, с которыми сталкиваются флуоресцентные белки, также связаны с их высоким сродством к олигомеризации. Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют по крайней мере ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria и его производных димеризоваться при иммобилизации в высоких концентрациях (например, когда связаны с плазматической мембраной). Этот артефакт также наблюдался в мотиве строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных в рифовых кораллах и морских анемонах. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок слит с белком-хозяином, который нацелен на конкретное субклеточное место. После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы.Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природных олигомеров (таких как актин, тубулин и щелевые соединения; см. Рисунок 4). Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (в действительности, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание, при условии, что локализованная концентрация остается низкой. Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, как описано выше, локализованная концентрация белка может стать достаточно высокой для обеспечения димеризации.Это явление может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые часто дают сложные наборы данных, которые иногда скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков медуз в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае имели бы ограниченный динамический диапазон.

Клеточный дистресс, приводящий к апоптозу или некрозу, является проблемой, которая возникает из-за чрезмерной концентрации синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков.Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое происходит при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров, светодиодов и дуговых разрядных ламп высокой интенсивности. В своем возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы склонны реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку.Флуоресцентные белки, как правило, не фототоксичны для клеток, частично из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки (см. Рисунок 3). При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально возможные длины волн возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах. Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, которые излучают в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными. К сожалению, низкие коэффициенты поглощения и квантовые выходы мономерных оранжевых и красных флуоресцентных белков препятствуют их широкому применению в анализе FRET. Возможно, по мере открытия новых вариантов флуоресцентных белков зонды в более длинноволновых цветных областях станут полезными акцепторами FRET для желтых и зеленых доноров.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET и не мешают другим важным биологическим явлениям.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки рифовых кораллов (обсуждаемые выше) имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным агентом для инактивации специфических белков с помощью хромофорной инактивации света ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший название KillerRed, способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности ECFP и EYFP показали, что даже через хромофоры, способные генерировать синглетный кислород, эти зонды неэффективны в качестве фотосенсибилизаторов. Однако продолжительное освещение клеток, экспрессирующих любой вариант EGFP, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, гибели клеток, что является определенным показателем возможности фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной покадровой визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, вращающегося диска, многофотонного и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. газоразрядная лампа против лазерной системы. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Первой парой флуоресцентных белков, разработанной для анализа FRET, был синий вариант (EBFP) в сочетании с EGFP, предназначенный для возбуждения источником ультрафиолетового света. К сожалению, относительно плохие фотофизические свойства EBFP вместе с потенциальной фототоксичностью коротковолнового освещения сделали эту комбинацию непрактичной. Новые варианты синего флуоресцентного белка могут воскресить эту стратегию спаривания для краткосрочных наблюдений, но им все равно будет мешать потребность в высокоэнергетическом возбуждении, что исключает использование голубых флуоресцентных белков для долгосрочной визуализации.Самая эффективная пара флуоресцентных белков FRET остается высокоэффективным вариантом ECFP в качестве донора, соединенным с высокоэффективным вариантом EYFP в качестве акцептора. Другие сочетания включают EGFP или производное EYFP в качестве донора для оранжевых и красных вариантов, таких как мономерный Kusabira Orange или mCherry. Среди проблем, связанных с применением оранжевых и красных флуоресцентных белков (все они получены из рифовых кораллов и морских анемонов) в качестве акцепторов FRET, являются длинные хвосты возбуждения, представленные в спектральных профилях поглощения.Во многих случаях спектры поглощения простираются в голубую и зеленую области спектра, что приводит к прямым артефактам возбуждения акцепторов.

Свойства пар флуоресцентных белков для спектральной визуализации FRET

Флуоресцентный Белок Пара	Донор Возбуждение Максимум (нм)	Приемник Излучение Максимум (нм)	Донор Quantum Выход	Акцептор Коэффициент экстинкции	Förster Расстояние (морских миль)	Яркость Коэффициент
EBFP2-mEGFP	383	507	0.56	57 500	4,8	1: 2
ECFP-EYFP	440	527	0,40	83 400	4,9	1: 4
Церулеанско-Венера	440	528	0.62	92 200	5,4	1: 2
MiCy-mKO	472	559	0,90	51 600	5,3	1: 2
TFP1-m Вена	492	528	0.85	92 200	5,1	1: 1
CyPet-YPet	477	530	0,51	104 000	5,1	1: 4.5
EGFP-mCherry	507	510	0.60	72,000	5,1	2,5: 1
Венера-mCherry	528	610	0,57	72,000	5,7	3: 1
Venus-tdTomato	528	581	0.57	138 000	5,9	1: 2
Venus-mPlum	528	649	0,57	41 000	5,2	13: 1

Таблица 1

Недавнее расширение цветовой палитры флуоресцентных белков для создания вариантов, обладающих широким спектром спектральных профилей, в сочетании с возрастающей сложностью конструкции белковых химер (слитые и биосенсоры), привело к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, потенциально полезен в экспериментах FRET (см. Таблицу 1).Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция, как кратко обсуждается выше), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком. Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках.Методы измерения FRET

В связи с тем, что практически все комбинации флуорофоров, используемые для мониторинга FRET, затруднены отдельными и часто уникальными проблемами, которые усложняют их применение для этого метода, для исследователя критически важно полностью понять методологию, в соответствии с которой используется FRET. измеряется. Исследователи должны использовать как можно больше различных методов измерения при проведении пилотных экспериментов с новыми комбинациями FRET с биологическими последствиями.После того, как система была настроена, а результаты согласованы и хорошо поняты, простейшие экспериментальные подходы могут быть использованы для дополнительных измерений. Несмотря на то, что для измерения FRET было разработано большое количество методов, многие из них очень сложны и требуют оборудования, которого нет в большинстве центров микроскопии керна. Наиболее практичные подходы к измерению FRET ограничиваются несколькими методами, которые будут рассмотрены ниже.

Высокая степень спектрального перекрытия между профилями излучения донора и поглощения акцептора, необходимая для FRET, также создает значительный уровень фонового шума, который может существенно мешать обнаружению сигналов FRET.Как обсуждалось ранее, спектральное просачивание, возможно, является основной проблемой при разделении сигналов FRET для анализа. Как донор, так и акцептор обычно вносят свой вклад в просачивание, которое можно обнаружить в канале FRET. Просачивание от донора происходит из-за перекрытия профилей излучения флуоресценции донора и акцептора, которые часто очень широкие (более 100 нанометров) и их трудно разделить. Напротив, утечка из акцептора является результатом прямого возбуждения акцепторных флуорофоров освещением, которое используется для возбуждения донора и образования FRET.Большое количество других источников шума также могут испортить измеренный сигнал FRET. К ним относятся автофлуоресценция, детектор микроскопа и оптический шум, а также вариации спектральной чувствительности в донорных и акцепторных каналах. В результате наиболее полезный подход к измерению точных сигналов FRET требует применения методологии, которая может либо избежать, либо успешно удалить загрязняющие фоновые сигналы.

«утечки сигнала» можно в значительной степени избежать, используя методы FRET, такие как фотообесцвечивание акцептора (также обычно называемое , ослабление гашения донора ; см. Рисунок 5) и микроскопию визуализации времени жизни флуоресценции ( FLIM ), но эти методы также могут вводить другие ограничения.Метод фотообесцвечивания акцептора используется для определения эффективности FRET путем измерения величины подавленного донорного сигнала (рис. 5 (а)) в присутствии акцептора с последующим измерением ослабленного донорного сигнала после того, как флуоресценция акцептора была разрушена посредством фотообесцвечивание (рис. 5 (б) и 5 (в)). Основополагающая концепция фотообесцвечивания акцептора FRET заключается в том, что флуоресценция донора тушится в результате резонансной передачи энергии акцептору. В результате фотообесцвечивание акцептора увеличивает флуоресценцию донора из-за потери эффекта тушения.Таким образом, если FRET происходит между донором и акцептором, флуоресценция донора должна увеличиваться, когда акцептор эффективно удаляется после фотообесцвечивания. Одним из преимуществ фотообесцвечивания акцепторов является то, что каждая исследуемая клетка служит отдельным контролем, что делает этот метод одним из наиболее точных для измерения FRET.

Основная задача при выполнении измерений FRET фотообесцвечивания акцептора заключается в том, чтобы убедиться, что донор также не подвергается фотообесцвечиванию, и что акцептор фотообесцвечивается (как минимум) примерно до 10 процентов от его первоначального значения.Любое фотообесцвечивание донора приведет к недооценке эффективности FRET из-за потери сигнала. Кроме того, поскольку акцептор необратимо фотообесцвечивается (фактически разрушается), метод фотообесцвечивания акцептора не может быть повторен на той же ячейке. Кроме того, из-за высокой фотостабильности, которую демонстрируют многие флуоресцентные белки, фотообесцвечивание акцептора может занять несколько минут и менее полезно для динамических измерений в живых клетках. Измерения фотообесцвечивания акцептора также могут быть нарушены, если вся ячейка не будет отбелена за один этап.Фотообесцвечивание выбранной области цитоплазмы позволяет притоку свежих флуорофоров в обесцвеченную область, что увеличивает время, необходимое для обесцвечивания всех акцепторных молекул в клетке. Помимо этих проблем, фотообесцвечивание акцептора все еще широко используется для определения эффективности FRET и обеспечивает отличный контроль после проведения экспериментов, основанных на альтернативных методах.

Мониторинг времени жизни донорной флуоресценции в экспериментах FRET можно использовать, чтобы избежать многих проблем, часто встречающихся при методах фотообесцвечивания акцепторов.FLIM, пожалуй, самый строгий метод, используемый для измерения FRET, и он менее склонен к просачиванию артефактов, поскольку измеряет только колебания флуоресценции донора. Все флуорофоры, включая флуоресцентные белки, демонстрируют экспоненциальное затухание их флуоресцентного излучения, которое можно измерить в наносекундной шкале времени. Скорость этого экспоненциального затухания чувствительна к любым процессам, которые влияют на возбужденное состояние, включая множество переменных окружающей среды, которые могут подавлять флуоресценцию.Таким образом, основная концепция, связанная с FLIM, связана с фотообесцвечиванием акцептора в том смысле, что его можно использовать для обнаружения изменений времени жизни донорной флуоресценции, которые сопровождают передачу энергии акцептору. Фактически, флуоресценция донора гасится FRET, и степень этого гашения может быть определена путем измерения изменений времени жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора.

Комбинация FLIM с FRET может облегчить проблемы с артефактами прямого возбуждения акцептора, которые усложняют другую методологию, и этот метод также можно использовать для мониторинга FRET с использованием акцепторов, которые сами не являются флуоресцентными.Однако у FLIM есть ограничения, которые не позволяют ему стать самым популярным методом для получения изображений FRET. Главное соображение заключается в том, что наносекундные измерения срока службы чрезвычайно сложны и должны проводиться с использованием дорогостоящих приборов, которые не являются широко доступными. Кроме того, FLIM часто требуется несколько минут для сбора каждого изображения, что серьезно ограничивает его применение для быстрых динамических событий. Еще одно осложнение — это многоэкспоненциальные кривые спада времени жизни, которые обычно встречаются у многих флуорофоров, которые обычно требуют более всеобъемлющих стратегий сбора данных и усложняют анализ FRET.Наконец, измерения FLIM чувствительны к факторам окружающей среды за пределами FRET, которые могут сократить измеряемый срок службы, включая автофлуоресценцию, вязкость, изменения pH и присутствие ионов металлов. Все только что описанные переменные снижают эффективность использования только методов акцепторного фотообесцвечивания и FLIM, однако они представляют собой важные средства контроля для проверки измерений FRET, полученных другими методами.

Самый простой и простой метод измерения FRET известен как сенсибилизированное излучение (в литературе обычно называют двухцветное ратиометрическое изображение ; см. Рисунок 6), который может быть выполнен на стандартном широкоугольном микроскопе, оборудованном соответствующей флуоресценцией. наборы фильтров.При сенсибилизированной эмиссии донорный флуорофор возбуждается определенной полосой длин волн, и сигнал собирается с использованием двух наборов эмиссионных фильтров, настроенных на флуоресценцию донора или акцептора. Этот метод может дать результаты очень быстро (ограничен только ограничениями переключения колес фильтров) и поэтому весьма полезен при динамической визуализации живых клеток. В том маловероятном случае, когда не происходит просачивания между возбуждением и испусканием двух флуорофоров, сенсибилизированное излучение будет преобладающим методом измерения FRET.К сожалению, просачивание обычно представляет собой значительную проблему, особенно при использовании флуоресцентных белков, а сенсибилизированное излучение требует обширных контрольных экспериментов, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Кроме того, эти элементы управления должны подвергаться значительной обработке изображения, чтобы вычесть проступание, ограничение, которое замедляет время сбора данных, увеличивает уровень шума и вносит относительно высокую степень неопределенности в измерения.

На рисунке 6 представлена серия изображений, полученных при широкоугольном флуоресцентном освещении кальциевых волн, пересекающих цитоплазму клеток карциномы человека ( HeLa ), экспрессирующих циркулярно пермутированный вектор YC3 камелеона.60. Этот биосенсор содержит варианты ECFP и EYFP, которые соединяют белок кальмодулин и кальций-кальмодулин-связывающий домен киназы легкой цепи миозина ( M13 ) в линейной химере. В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками. На рисунке 6 (а) представлено реальное цветное изображение двух соседних клеток перед добавлением гистамина для индукции связывания кальция с биосенсором.На рисунках с 6 (b) по 6 (h) показаны изображения в псевдоцветном соотношении кальциевых волн, распространяющихся через цитоплазму двух клеток HeLa. Обратите внимание, что волна распространяется сверху вниз в верхней ячейке и справа налево в нижней ячейке. Общее время прохождения кальциевой волной цитоплазмы в этих клетках составляло приблизительно 1,5 секунды. Уровень FRET указывается путем сравнения логометрических псевдоцветов с легендой, представленной на рисунке 6 (а). Изображения на рисунке 6 были получены с использованием двухдиапазонного дихроматического светоделителя, соединенного с фильтрами возбуждения и излучения, настроенными на оптимальные диапазоны длин волн для визуализации ECFP и EYFP с минимальным просачиванием.

Для сенсибилизированного излучения был описан ряд корректирующих подходов с использованием нескольких различных комбинаций фильтров с контролями, которые содержат только донор, только акцептор или образец FRET как с донором, так и с акцептором. Элементы управления позволяют исследователю определить уровень просачивания возбуждения и излучения и вычесть его из измерения FRET. Однако из-за всех необходимых поправочных коэффициентов количество шума в окончательном FRET-изображении может превышать уровень сенсибилизированного излучения в ситуациях, когда взаимодействие между донором и акцептором является слабым.Спектральная визуализация в измерениях FRET

В приложениях FRET построение спектральных изображений можно рассматривать как разновидность метода сенсибилизированного излучения, основанного на возбуждении только донора с последующим получением всего спектра излучения как донорной, так и акцепторной флуоресценции вместо сбора данных по двум независимым каналам. До появления лазерных сканирующих конфокальных микроскопов, предназначенных для получения спектральных изображений, методика в основном ограничивалась спектроскопическими экспериментами с использованием кювет и очищенных флуорофоров.Спектральная визуализация FRET предполагает, что сбор всего спектра флуоресценции позволит разделить перекрывающиеся спектральные профили в соответствии с различными формами спектров, а не просто контролировать интенсивность излучения в ограниченной области полосы пропускания с использованием фильтра. Таким образом, собирая весь спектр как от донора, так и от акцептора (см. Рисунок 7 (a)), можно с помощью спектральной визуализации определить уровни флуоресценции донора и акцептора и на основе этой информации (в сочетании с контролями) вычислить эффективность FRET.

На рис. 7 представлено логометрическое измерение спектрального изображения для флуоресцентного белкового биосенсора кальция, известного как cameleon YC3.60, как описано выше. Спектральные профили YC3.60 в присутствии (красная кривая; рис. 7 (а)) и отсутствии (желтая кривая) кальция демонстрируют высокий динамический диапазон зонда при 530 нанометрах. Мультяшные рисунки биосенсора Cameleon представлены в присутствии (Рисунок 7 (b)) и в отсутствие (Рисунок 7 (c)) кальция, чтобы проиллюстрировать, как щелочной металл вызывает конформационные изменения в M13 для перемещения двух флуоресцентных белковых частей ближе друг к другу. .Лямбда-стек изображений в 10-нанометровых интервалах клеток, экспрессирующих камелеон в присутствии высокой концентрации кальция, показан на рисунке 7 (d). Обратите внимание, что самые высокие интенсивности наблюдаются для лямбда-плоскости, содержащей длины волн излучения от 530 до 540 нанометров.

Сравнение спектрального изображения с линейным несмешиванием и сенсибилизированного излучения с двумя длинами волн возбуждения для определения FRET показывает, что отношение сигнал / шум для методов сенсибилизированного излучения ниже, чем у спектрального изображения (хотя это не всегда так и зависит от сильно зависит от параметров и конфигурации прибора).Это несоответствие связано с тем, что фильтры излучения с относительно узкой полосой пропускания, необходимые для разделения излучения от близко перекрывающихся флуорофоров, блокируют большинство используемых фотонов, которые в противном случае обнаруживаются с помощью спектральной визуализации. Отбрасывание большого количества выбросов приводит к значительной потере информации, которая в некоторых случаях приближается к 50 процентам имеющихся данных. Кроме того, спектральная визуализация обеспечивает оптимальное взвешивание в соответствии с шумом, присутствующим в отдельных каналах данных, в отличие от традиционных методов (часто отбрасываемых произвольно).Спектральная визуализация требует предварительного определения уровня проступания из-за прямого возбуждения акцептора, но этот метод может выиграть от использования двух длин волн возбуждения с инструментами, которые так оснащены.

Конфокальные микроскопы

для получения спектральных изображений, оснащенные акустооптическими перестраиваемыми фильтрами ( AOTF ) и специализированными детекторными системами, могут использоваться для получения серии изображений в дискретных ограниченных диапазонах длин волн для генерации так называемых лямбда-сумм (изображения боковых ( x, y ) как функция длины волны).Спектральные сигнатуры ( эмиссионных отпечатков ) для отдельных флуорофоров или флуоресцентных белков и загрязняющих фоновых сигналов (таких как автофлуоресценция) получают в результате деконволюции лямбда-стопок. Метод линейного разделения может быть применен к лямбда-сумме для разделения вкладов отдельных сигналов флуорофора в каждый пиксель полученного изображения. Таким образом, спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием может определять и устранять вклад донора в сигнал FRET.Однако из-за того факта, что флуоресцентное излучение, производимое прямым возбуждением акцептора (называемое просачиванием акцептора, см. Выше), идентично по спектральным характеристикам сигналу флуоресценции, производимому FRET, необходимо разработать элементы управления, которые помогают определить и устранить вклад акцепторного просачивания, чтобы получить эффективность FRET. Спектральную визуализацию также можно комбинировать с фотообесцвечиванием акцептора или использовать для изучения динамических изменений эффективности FRET в флуоресцентных белковых биосенсорах без использования контролей.Последняя стратегия является, пожалуй, наиболее широко применяемым методом исследования FRET с помощью спектральной визуализации.

Для устранения просачивания спектрального излучения акцептора из-за перекрестного возбуждения в приложениях FRET для получения спектральных изображений большинство подходов основано на предположении, что при отображении в идентичных условиях динамика этих артефактов будет по существу одинаковой в контрольных ячейках, которые экспрессируют только акцептор (по сравнению с экспериментальными клетками, которые экспрессируют как донор, так и акцептор).Однако из-за того, что разные ячейки используются для определения вклада проступания в экспериментальных ячейках, отдельные местоположения пикселей нельзя сравнивать напрямую. В большинстве случаев можно сравнить пиксели как в контрольных, так и в экспериментальных клетках, которые имеют совпадающие уровни флуоресценции. Этот метод основан на алгоритме, который определяет уровни флуоресценции пиксель за пикселем и устанавливает уровень проступания в контрольных клетках, которые экспрессируют только акцептор.Эти контрольные значения проступания затем применяются в качестве поправочного коэффициента к соответствующим совпадающим пикселям в экспериментальных ячейках, которые выражают как донорные, так и акцепторные флуорофоры.

В парах FRET флуоресцентных белков, которые сконструированы с вариантами голубых и желтых флуоресцентных белков (ECFP и EYFP), для получения спектральных изображений требуется возбуждение голубого варианта с использованием лазерной спектральной линии, которая перекрывается с профилем поглощения флуоресцентного белка. В современных конфокальных микроскопах используются диодные и газовые лазеры со спектральными линиями 405, 440 и 458 нанометров, каждый из которых полезен для возбуждения голубых флуоресцентных белков.Однако спектральная линия 458-нанометров от аргон-ионного газового лазера приводит к значительному просачиванию акцептора (примерно 20 процентов) в канал FRET для пар ECFP-EYFP. Напротив, диодные лазеры с длиной волны 405 и 440 нм будут генерировать меньше проступания (примерно 4 и 8 процентов, соответственно), но загрязняющий сигнал от прямого акцепторного возбуждения все равно должен быть удален для точного расчета сигнала FRET. После установления соотношения интенсивностей изображения донора в присутствии ( I _DA ) и отсутствии ( I _D ) акцептора эффективность FRET может быть определена с помощью следующего соотношения:

E _FRET = 1 — (I _DA / I _D)

Расчет эффективности FRET таким способом был подтвержден с использованием пар флуоресцентных белков FRET, которые были слиты вместе с короткими пептидными линкерами, а также гораздо более сложной задачи исследования FRET между зондами, которые экспрессируются отдельно.Результаты показали очень похожие значения эффективности FRET при сравнении спектральной визуализации с методологией на основе интенсивности и FLIM. Однако спектральная визуализация позволяет избежать потенциальных проблем, связанных с просачиванием акцепторного сигнала в донорный канал, что является обычным явлением для сенсибилизированного излучения на основе фильтров и визуализации с многофотонным возбуждением. Следует обратить внимание на то, что компонент спектрального просвечивания акцептора часто является незначительным и может создавать проблемы при количественной оценке уровня сигнала при использовании детекторов с фотоумножителями, которые имеют нестабильный отклик при очень низких значениях интенсивности.Этот артефакт можно преодолеть, определив просачивание на разных уровнях интенсивности в контрольных ячейках.

Перекрестного возбуждения акцептора можно избежать, выбирая пары FRET флуоресцентного белка, у которых есть донор с большим стоксовым сдвигом. Например, mT-Sapphire и mAmetrine являются производными GFP, которые поглощают свет в ультрафиолетовых длинах волн (приблизительно 400 нанометров), но излучают либо в зеленой (510 нанометров), либо в желтой (530 нанометров) областях спектра.Когда эти доноры сочетаются с оранжевыми или красными флуоресцентными акцепторами белка, возбуждение пары FRET вызывает скудное просачивание акцептора и не требует корректирующих факторов или контролей. Например, соединение производной GFP, известной как GFP2, с EYFP привело к образованию пары FRET, которая может быть возбуждена с помощью 405-нанометрового диодного лазера и успешно наблюдаться с помощью спектральной визуализации. Поскольку GFP2 и EYFP имеют сильно перекрывающиеся спектры излучения, линейное разделение данных FRET позволяет определить вклад каждого флуорофора в общее излучение флуоресценции.Аналогичным образом, связывание мАметрина с тандемно-димерным томатом (tdTomato) дает пару FRET, которая излучает оранжево-красную флуоресценцию при возбуждении на 405 нанометрах. Возбуждение только tdTomato на этой длине волны практически не дает детектируемого сигнала, поэтому при использовании этой пары нет необходимости корректировать просачивание акцептора. Подобные пары FRET, вероятно, дадут идентичные результаты.

Из-за неспособности конфокальной микроскопии спектральной визуализации различать эмиссионный сигнал акцептора, генерируемый посредством FRET, и сигнал, происходящий от прямого возбуждения акцептора в флуоресцентном белке и других парах флуорофоров, которые имеют сильно перекрывающиеся спектральные профили, необходимые для FRET, несколько исследователей объединили спектральная визуализация с методами фотообесцвечивания акцепторов для определения эффективности FRET.На рисунке 8 показан пример спектральной визуализации флуоресцентных белков с фотообесцвечиванием акцептора для анализа FRET. Флуорофор представляет собой химеру mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. При экспрессии в клетках млекопитающих (почки кролика) вектор слияния распространяется по цитоплазме и проникает в ядро. Спектральное изображение выраженного вектора в клетках, полученное от 450 до 650 нанометров, представлено на рисунке 8 (а), а изображения эмиссии mCerulean и mVenus с разрешенным спектром показаны на рисунках 8 (b) и 8 (c), соответственно.После фотообесцвечивания mVenus в ячейке, показанной в нижней части окна, светом 514 нм (Рисунок 8 (f)), флуоресцентное излучение mCerulean увеличивается (Рисунки 8 (d) и 8 (e)) как следствие донорства. обезвоживание.

Фотообесцвечивание акцептора обычно достигается с помощью лазерной спектральной линии, которая перекрывает область с высоким коэффициентом экстинкции (как можно ближе к пику) в спектре поглощения акцептора. Например, в комбинации ECFP-EYFP FRET для фотообесцвечивания EYFP обычно используется линия аргоново-ионного лазера с длиной волны 514 нанометров, что снижает гашение ECFP с последующим увеличением донорного сигнала (рисунки 8 (d) -8 (f)).Поскольку EFYP постепенно фотообесцвечивается, лямбда-сканирование спектрального изображения проводится с использованием 548-нанометровой линии аргон-ионного лазера (возбуждающего ECFP) между каждым событием фотообесцвечивания для регистрации изменений спектрального отклика. Как правило, лямбда-пакеты собираются по спектру длин волн от 465 до 600 нанометров в дискретной полосе пропускания (приблизительно 10 нанометров). Этот экспериментальный подход разработан для минимизации ошибки отдельных измерений путем подгонки изменений интенсивности к стандартной кривой.Значения максимального увеличения интенсивности ECFP могут быть затем экстраполированы из этой кривой, даже если EYFP никогда не подвергается фотообесцвечиванию полностью. Конечная цель — избежать повреждения живых клеток и нежелательного фотообесцвечивания ECFP в ходе эксперимента. Методы фотообесцвечивания акцептора дают оптимальные результаты, когда донор является фотостабильным, а акцептор — фотолабильным, и эту ситуацию можно контролировать, выбирая подходящие варианты флуоресцентного белка, такие как Cerulean и Venus.

Чтобы рассчитать эффективность FRET с использованием метода фотообесцвечивания акцептора, необходимо выполнить ряд шагов в стратегии анализа данных. Первый шаг состоит из линейного разделения компонентов ECFP и EYFP (или других флуорофоров, если они используются вместо них). Затем за измерением средней интенсивности доноров ECFP и акцепторов EYFP следует расчет изменений интенсивностей для определения эффективности FRET. После получения стопок лямбда используется линейное размешивание для создания изображений донора ECFP и акцептора EYFP из стопок.Общий успех линейного разделения зависит от наличия образцов, демонстрирующих хорошее отношение сигнал / шум, и использования эталонных спектров, которые точно представляют спектры, содержащиеся в образце FRET. В большинстве случаев клетки, экспрессирующие только ECFP или EYFP (контроль), используются для генерации эталонных спектров. Контрольные спектры должны быть получены в тех же условиях, что и для образца FRET, включая настройки усиления, смещение, диапазон длин волн, объектив и дихроматическое зеркало. Изображения должны быть получены с минимальной насыщенностью сигнала и минимальной интенсивностью пикселей, установленной чуть выше нуля, чтобы получить максимально возможный динамический диапазон.После вычитания фона эффективность FRET рассчитывается с использованием приведенного выше уравнения, где ( I _DA ) и ( I _D ) представляют собой нормированные интенсивности донора до и после 100-процентного фотообесцвечивания акцептора. В связи с тем, что EYFP почти никогда не обесцвечивается полностью, значение для ( I _D ) обычно экстраполируется из линейной аппроксимации графика, описывающего процентное увеличение выбросов ECFP по сравнению с процентным уменьшением EYFP.Технику фотообесцвечивания акцептора можно использовать с другими парами флуоресцентных белков (такими как EGFP и mKusabira Orange) аналогичным образом.

Уникальный подход к измерению FRET с помощью спектральной визуализации получил название лямбда FRET и оказался высокоспецифичным, чувствительным и надежным методом анализа резонансной передачи энергии в живых клетках. Алгоритм лямбда FRET основан на отображении образца FRET на нескольких длинах волн излучения с последующим разделением спектра FRET на его донорные и акцепторные компоненты для получения пиксельного расчета эффективности FRET.Lambda FRET применяет новую процедуру предварительной калибровки для коррекции спектрального просвечивания, основанную на получении эталонных отраженных изображений, и была проверена с использованием синтетических флуорофорных стандартов FRET (таких как Alexa Fluor 488 и Cy3), а также слияния флуоресцентных белков. (ECFP и EYFP) с переменной длиной линкера и стехиометрией. Уникальная процедура коррекции, основанная на использовании отраженных изображений для нормализации для различной интенсивности излучения, в принципе аналогична методам сенсибилизированного излучения, но дает результаты с меньшим шумовым загрязнением.Было продемонстрировано, что лямбда-FRET может быть полезен в случаях, когда высокое спектральное перекрытие и артефакты автофлуоресценции присутствуют как в сценариях визуализации фиксированных, так и живых клеток.

Помимо изучения межмолекулярных взаимодействий и определения эффективности FRET с использованием методов фотообесцвечивания акцепторов и коррекции просвечивания, спектральная визуализация оказалась очень полезной для исследования флуоресцентных белковых биосенсоров для определения наличия или отсутствия FRET в ответ на биологический стимул. .Методология требует получения спектра биосенсора в присутствии и в отсутствие стимулятора, чтобы определить, наблюдается или устраняется FRET, и контролировать динамический диапазон ответа (см. Рисунок 7). Таким образом, творчески объединив пары флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов или другой биологической активности, ряд исследователей разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для визуализации важных живых клеток. метаболические и сигнальные процессы.Обычно два флуоресцентных белка (обычно голубой и желтый варианты) вставляются на противоположных концах сенсорного белка или пептидной последовательности (см. Фиг.9), как кратко описано выше. Изменения конформации сенсорного белка вызывают соответствующие третичные изменения в структурной организации комплекса и, таким образом, в уровне FRET, который может наблюдаться между фланкирующими флуоресцентными белками. Ратиометрическое изменение выхода флуоресценции донора и акцептора с использованием одного параметра возбуждения в сочетании со спектральной визуализацией становится популярной методологией для исследования этих биосенсоров.

На рисунке 9 представлена карикатура, иллюстрирующая общие стратегии построения флуоресцентных белковых биосенсоров. Голубые цилиндры представляют собой CFP, серые цилиндры представляют YFP без FRET, а желтые цилиндры представляют YFP с FRET. Синие молнии указывают на возбуждение на 450 нм, а параллельные волны — на флуоресцентное излучение (на 475 нм, голубой; или 530 нм, желтый). Сенсорные домены имеют телесный цвет, а эффекторные агенты — сферы или эллипсы. На рисунке 9 (a) показан межмолекулярный FRET между отдельным сенсорным доменом и субстратом, слитым с CFP и YFP, соответственно, а на рисунке 9 (b) изображен флуоресцентный белковый биосенсор, содержащий один сенсорный домен и эффекторный лиганд.Связывание субстрата с сенсорным доменом на рисунке 9 (a) вызывает FRET, тогда как связывание лиганда на рисунке 9 (b) вызывает конформационное изменение сенсорного домена, чтобы привести флуоресцентные белки в правильную близость для передачи энергии (см. Рисунки 7 (б) и 7 (в)). В некоторых случаях домены субстрата и сенсорного белка связаны (рис. 9 (c)) для создания единой генетической единицы экспрессии для внутримолекулярного FRET, в отличие от ситуации на рис. 9 (a). Флуоресцентный белковый биосенсор, который обнаруживает расщепление субстрата (рис. 1 и рис. 9 (d)), работает посредством устранения FRET после того, как соответствующая протеаза была индуцирована.Биосенсоры протеазного расщепления являются популярными индикаторами апоптоза.

За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих различные пары FRET. Несмотря на ограничения динамического диапазона, наблюдаемые в некоторых биосенсорах FRET, использующих производные голубого и желтого цветов, использование этих флуоресцентных белков получило широкое распространение, вероятно, из-за простоты логометрических измерений, широкой доступности и простоты сравнения с другими датчиками, имеющими аналогичные свойства. .Начинают появляться альтернативные пары FRET, включая голубые и бирюзовые донорные флуоресцентные белки, связанные с желтыми и оранжевыми акцепторными флуоресцентными белками, а также зеленые флуоресцентные доноры белков, связанные с красными флуоресцентными белками-акцепторами. Однако на сегодняшний день полезность флуоресцентных белков, полученных из рифовых кораллов и морских анемонов, ограничена. Несколько многообещающих биосенсоров сопоставляют сапфировое или желтое производное GFP с красным флуоресцентным белком для получения репортера длинного стоксова сдвига, как обсуждалось выше.Без сомнения, появятся современные биосенсоры с использованием более точно настроенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов. С этой целью спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием будет по-прежнему рассматриваться как один из предпочтительных методов анализа FRET для увеличения нагрузки.

Выводы

Ряд методов был разработан для анализа FRET в флуоресцентных белках, а также в синтетических красителях и квантовых точках.Для визуализации живых клеток спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием обеспечивает надежный метод измерения FRET с использованием флуорофоров с сильно перекрывающимися спектральными профилями, ситуация, которая обычно встречается с образцами FRET. Новые флуоресцентные белковые биосенсоры обещают расширить горизонты динамических исследований субклеточной активности, и спектральная визуализация должна оказаться очень полезным инструментом в этой области. Для дальнейшего совершенствования аналитических методов спектральную визуализацию можно комбинировать с методами фотообесцвечивания на протяжении жизни или акцептора.Кроме того, возможность проведения экспериментов FRET с использованием двух разных акцепторов (имеющих разные спектры излучения) находится в пределах области спектральной визуализации, но гораздо труднее выполнять с использованием традиционной методологии.

Программное обеспечение для визуализации решетчатых световых листов биосенсоров FRET, проиллюстрированных с помощью нового биосенсора Rap1 | Журнал клеточной биологии

Решеточная световая микроскопия (LLSM) ценна тем, что сочетает в себе пониженное фотообесцвечивание и выдающееся пространственно-временное разрешение в 3D.Использование LLSM для визуализации биосенсоров в живых клетках может обеспечить беспрецедентную визуализацию быстрых локальных изменений конформации белка или посттрансляционных модификаций. Однако вычислительные операции, необходимые для получения изображений биосенсора с помощью LLSM, являются сложной задачей для многих программных пакетов. Расчеты требуют обработки больших объемов данных даже для простых изменений, таких как переориентация изображений ячеек или тестирование эффектов выбираемых пользователем настроек, а построение решетчатых изображений создает уникальные проблемы при определении пороговых значений и изображений соотношений.Мы описываем здесь новый программный пакет ImageTank, специально разработанный для практической визуализации биосенсоров с использованием LLSM. Чтобы продемонстрировать его возможности, мы используем новый биосенсор для изучения быстрой трехмерной динамики малой GTPase Rap1 в пузырьках и выпячиваниях клеток.

Решеточная световая микроскопия (LLSM) обеспечивает уникальное сочетание возможностей. Он может быстро создавать серию флуоресцентных изображений с разрешением до 220 × 220 × 370 нм и со значительно сниженным фотообесцвечиванием по сравнению с другими методами трехмерной флуоресцентной визуализации (Chen et al., 2014). LLSM уже позволил значительно улучшить представление о поведении множества клеток и организмов (Strom et al., 2017; Valm et al., 2017; McArthur et al., 2018). Использование LLSM вместе с флуоресцентными биосенсорами может еще больше расширить его возможности, выявляя не только локализацию белка, но и активность белков в реальном времени. Визуализация биосенсора может количественно оценить динамику различных событий активации, включая конформационные изменения, события фосфорилирования, расщепление и взаимодействия связывания (Goguen and Imperiali, 2011; Mehta and Zhang, 2011; Zhang et al., 2018). Однако количественная оценка активности биосенсора требует обширной обработки изображений, что особенно сложно для LLSM из-за огромного объема данных, генерируемых этим методом, и требуемых вычислительных операций для количественной оценки активности белка по данным биосенсора. Это привело нас к разработке сценариев для LLSM на графическом языке программирования DataTank (https://www.visualdatatools.com), чья высокоэффективная архитектура хорошо подходила для задач построения образов LLSM.Первоначальный успех этого подхода побудил нас разработать новое программное обеспечение для обработки изображений, ImageTank, чтобы включить эффективность, присущую этому языку программирования, в удобный графический пользовательский интерфейс для количественной оценки и визуализации активности биосенсора в 3D с течением времени. Эти скрипты были разработаны специально для данных LLSM, но могут быть адаптированы к другим модальностям визуализации.

Чтобы использовать возможности LLSM, мы разработали новый биосенсор для небольшой GTPase Rap1.Rap1 координирует очень разнообразные клеточные процессы и, как полагают, обеспечивает связь между вовлечением интегринов на вентральной поверхности и удаленными динамическими складками (Arthur et al., 2004; Takahashi et al., 2008; Miyata et al., 2009). Используя быструю 3D визуализацию активности Rap1, мы количественно оценили одновременную регуляцию Rap1 в этих различных локализациях и идентифицировали связи между активацией на вентральной поверхности и в периферических складках.

Мы разработали биосенсор с двойной цепью (межмолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера [FRET]) для Rap1 (репортер флуоресцентной активности Rap1 [FLARE]), состоящий из N-конца Rap1, слитого с акцепторным флуорофором, mCerulean3 (Markwardt et al., 2011), и Rap1-связывающий домен (RBD) эффекторного белка RalGDS, слитый с акцепторным флуорофором YPet (Nguyen and Daugherty, 2005; Fig. 1 A). Использование двухцепочечных биосенсоров может быть затруднено из-за межклеточной вариации относительного уровня экспрессии двух цепей. Чтобы преодолеть это, мы разработали оптимизированную вирусную последовательность 2A, которая экспрессирует оба белка из одной мРНК, что значительно снижает вариабельность относительной стехиометрии сенсорных цепей (рис. 1 B). Rap1 FLARE был подтвержден путем тестирования взаимодействия конститутивно активных и доминантно-отрицательных мутантов (рис.1 C), его ответ на нативные регуляторы (рис. 1 D), эффекты мутаций, которые изменяют взаимодействие RBD-Rap1 (рис. 1 E), и ответы в живых клетках (рис. 1, F и G). Важно отметить, что конструкция с двумя цепями давала нулевой FRET в выключенном состоянии, что в сочетании с яркими флуорофорами привело к получению чувствительного репортера активности и упрощенному размещению флуорофоров для максимальной эффективности FRET. С помощью этого биосенсора мы визуализировали клетки Cos7, когда они мигрировали по покрытым фибронектином покровным стеклам. Мы получили 199 срезов на ячейку, и для каждого среза мы собрали FRET (возбуждение донора / испускание акцептора) и CFP одновременно на двух дополнительных камерах металл-оксид-полупроводник (sCMOS), а затем собрали YFP для коррекции просвечивания (рис.2). Общее время сбора данных на момент времени составляло ∼8 с, и мы получили 90–180 карт активности целых клеток за 11,8–24,2 мин, что составляет до 30 ГБ данных на клетку.

Из-за больших объемов данных, которыми нужно было манипулировать для получения изображений биосенсора в 3D, важно было эффективно обрабатывать данные. Нам нужно было использовать подход, который не повторял бы вычисления всякий раз, когда пользователь менял стандартные параметры визуализации (например,g., вращение, экспонированный срез или масштабирование). Поэтому созданные нами скрипты сохраняли промежуточные результаты в памяти, чтобы избежать повторных вычислений, и автоматически очищали результаты при изменении входных данных. Если ввод не изменился, программа вернула сохраненный результат, а не пересчитывала сложные задачи. Функциональные задачи были разделены на категории в зависимости от сложности выполнения, относительных размеров входных / выходных данных и повторения вызовов функций. На основании этих свойств и вычислительных потребностей рабочего процесса данные были выбраны для хранения либо в памяти (быстро), либо на диске (медленно).Это позволило нам редактировать параметры в любом месте рабочего процесса и немедленно визуализировать или анализировать количественные результаты без повторного расчета задач, на которые это изменение не повлияло. Все файлы изображений, связанные с данной ячейкой, были преобразованы в один оптимизированный файл, который включал необработанные данные из каждого канала сбора данных, настройки микроскопа, файлы конфигурации и соответствующую информацию обработки. Эти данные хранились в больших непрерывных блоках для ускорения чтения / записи и не содержали посторонней служебной информации, характерной для стандарта.tif файлы. Скрипты выполняют коррекцию плоского поля, регистрацию, вычитание фона, коррекцию фотообесцвечивания (Hodgson et al., 2006), сквозную коррекцию и установление пороговых значений (рис. 2) для данных четырехмерного биосенсора (Hodgson et al., 2010). Они позволяют непрерывно воспроизводить видео даже во время манипуляций с данными, отображать активность белков в виде твердого трехмерного объема, который можно анализировать на любой плоскости, а также одновременно визуализировать несколько поверхностей или интересующих объектов. Кроме того, эти модульные сценарии могут быть расширены для включения дополнительного анализа либо с помощью внешних функций, закодированных в python, но выполняемых в ImageTank, либо путем экспорта данных в формате.mat (MATLAB) или файлы .xlsx (Excel).

После выполнения стандартной коррекции изображения была рассчитана активность биосенсора для всего куба данных, и ячейка была сегментирована. Сегментация или определение границы ячеек было сложной задачей, потому что оси куба данных не ортогональны, а разрешение различается по x, y и z. В нашем подходе к сегментации мы предположили, что существует лежащая в основе непрерывная функция интенсивности в 3D, которая дискретизируется в масштабе вокселя.Пользователь определяет пороговые значения для отдельных 2D-срезов, чтобы сгенерировать функцию пороговых интенсивностей в пространстве. Эта пороговая функция использовалась для визуализации трехмерного объема ячеек с помощью тесселяции с использованием алгоритма марширующих кубов (Lorensen and Cline, 1987; рис. S1). Эта процедура интерполировала треугольные плоскости между центрами вокселей, чтобы получить законченную связанную поверхность с точностью до субпикселей. В отличие от метода сегментации на основе пикселей, тесселяция более точно захватывает край ячейки даже на изображениях с более низким отношением сигнал / шум (рис.S2). При разработке этой схемы мы решили установить пороги на основе флуоресцентного белка YPet от биосенсора вместо использования отдельного мембранного маркера, чтобы сохранить дополнительные каналы флуоресценции для будущих исследований мультиплексирования. Использование тесселяции было важным для этого процесса, потому что в некоторых частях клетки края не были так четко определены, как это было бы с мембранным маркером или как в широкоугольной микроскопии с изображениями более высокой интенсивности. Ключевым преимуществом LLSM является уменьшение фотообесцвечивания, что позволяет в течение длительного времени визуализировать более низкие концентрации биосенсоров, которые не нарушают биологию клетки.

Автоматическая сегментация ячеек была одной из самых сложных задач при работе с этими данными. Мы исследовали методы на основе гистограмм, градиентов и адаптивные методы, но ни один из них не смог уловить все различные особенности образцов. Наиболее успешно мы использовали подход, основанный на гистограммах, для деконволютированных данных, но когда мы сопоставили полученные контуры с недеквертированными данными, мы не были уверены в наложении.Визуальная оценка для изменения пороговых значений как в пространстве, так и во времени, хотя и утомительна, была наиболее надежным методом сегментации ячейки. Мы уверены в характеристиках ячеек, которые описываем, поскольку неоднократно тестировали эффекты различных пороговых значений. Мы продолжаем работать над автоматизированными методами для внедрения в будущих версиях программного обеспечения.

Изображения, полученные в LLSM, находились под углом 31,8 ° от покровного стекла, и их необходимо было выровнять и интерполировать, чтобы визуализировать объект с правильными размерами и обычной ориентацией (Chen et al., 2014; Рис.2). Чтобы отобразить трехмерную сетку исходных данных изображения на физически точную новую сетку, мы применили полное преобразование с поправкой на угол и физическое расстояние между срезами, которые определялись размером шага во время получения. После устранения перекоса мы использовали интерполяцию на определяемой пользователем сетке для создания твердого трехмерного объекта, который можно было анализировать на любой плоскости. Размер шага в LLSM был достаточным для точной интерполяции информации между срезами, что позволило нам измерить интересующие характеристики в физических единицах.Удобные графические пользовательские интерфейсы, связанные с каждым этапом процесса, были закодированы как модульные компоненты, которые могут быть включены по мере необходимости пользователями и могут быть применены к любой технике 4D-изображения.

Вычислительные подходы были разработаны и оптимизированы с использованием биосенсора Rap1 для подтверждения принципиальных исследований. Это наглядно продемонстрировало способность LLSM выявлять быструю трехмерную динамику и визуализировать корреляции даже между кратковременными активациями в клетке.Rap1, как было обнаружено, связан с внутриклеточными пузырьками, которые происходят из (Видео 1) и сливаются с (Видео 2) вентральными и дорсальными клеточными мембранами (Рис. 3). Это также было замечено в спинных складках (Рис. 4 и Видео 3 и 4), в боковых выступах (Видео 5) и под клеткой (Рис. S3). Клетки помещали на фибронектин для стимуляции выпячиваний, индуцированных интегрином. В соответствии с предыдущими исследованиями, показывающими, что Rap1 опосредует активацию интегрина и контроль протрузий (Arthur et al., 2004; Takahashi et al., 2008; Miyata et al., 2009), на протяжении наших наблюдений мы видели активацию Rap1 на больших участках вентральной клеточной поверхности. Напротив, активация внутри складок была быстрой и преходящей и включала поразительные локализованные всплески активности, которые было бы трудно охарактеризовать без превосходного пространственно-временного разрешения LLSM (рис. 4 и видео 3 и 4). В некоторых случаях наблюдались непрерывные «мостики» активированного Rap1, соединяющие вентральную мембрану с дорсальными складками (Видео 6). Rap1 активировался в везикулах двух разных типов (рис.3). В 25% клеток мы видели движущиеся везикулы с очень низкой активностью Rap1 в их центре, но частичную оболочку с высокой активностью по периферии. Эти пузырьки (диаметр 1,2–4,4 мкм) с морфологией, напоминающей макропино- сомы, образованы либо на вентральной, либо на дорсальной поверхностях и в некоторых случаях происходят из складчатости на клетке (видео 7). 42% клеток содержали крупные (1,5–4,7 мкм) продолговатые тела с активным Rap1 на всем протяжении. Они были преимущественно перинуклеарными и вращались вокруг ядра (видео 8).Размеры этих пузырьков были рассчитаны с использованием набора инструментов, которые мы разработали (рис. S4).

Биосенсоры

были проверены с использованием анализа на планшетах, описанного ранее (Slattery and Hahn, 2014). Вкратце, клетки LinXE 293T помещали в 96-луночные планшеты и временно трансфицировали соответствующими конструкциями с использованием липофектаминового реагента (50470; Invitrogen). Клетки инкубировали в течение 16-24 ч, визуализацию получали с помощью 10-кратного объектива (0.3 нет данных; воздуха; Olympus) с помощью управляющего программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices) и проанализировали с помощью пользовательских скриптов MATLAB (MathWorks). Чтобы измерить скорректированное соотношение FRET для конститутивно активных (G12V) и доминантно-отрицательных (S17N) мутантов, фиксированное количество ДНК (5 нг) для экспрессии mCerulean3-Rap1 (WT, конститутивно активный или доминантно-отрицательный) было трансфицировано вместе с титрование RalGDS-YPet на несколько порядков величины (0,19–50 нг). Чтобы можно было сравнить планшеты, полученные в разные дни с разными микроскопами, на каждом планшете содержалось не менее двух повторов мутанта G12V, и весь планшет был нормализован до среднего максимального FRET мутанта G12V (12-13 повторов, пять планшетов, 3 г).Ошибка отображается как SEM. Для количественной оценки регуляции фактора обмена гуаниновых нуклеотидов (CalDAG-GEF1) и белка, активирующего ГТФазу (Rap1GAP1), фиксированное количество (10 нг) биосенсора WT Rap1, экспрессируемого с помощью вирусной последовательности 2A (см. Выше), трансфицировали, в то время как Регулятор Rap1 титровали на несколько порядков (0,39–100 нг). Каждую чашку нормализовали к средней максимальной FRET титрования CalDAG-GEF1 (пять повторов, четыре чашки, 2 дня). Ошибка отображается как SEM. Были введены точечные мутации, которые, как известно, отменяют связывание RalGDS с Rap1 (K48A, h59A), и RalGDS (K48A / h59A) -YPet, RalGDS (K48A) -YPet или RalGDS-YPet титровали против фиксированного количества mCerulean3-Rap1G12V.Каждую чашку нормализовали к среднему максимальному FRET RalGDS-YPet (12 повторов, шесть чашек, 2 дня), и наивысшая концентрация была показана в виде прямоугольников и усов. На графике в виде ящика и усов середина прямоугольника — это медиана, края прямоугольника — это первый и третий квартили, а линии за пределами поля — минимальное и максимальное значения.

микроскопов LLSM, используемых в этих экспериментах, размещены в лаборатории Бетцига и в Центре усовершенствованных изображений в Медицинском институте Говарда Хьюза, исследовательском кампусе Джанелия.Клетки Cos7 временно трансфицировали биосенсорной плазмидой за 16-24 ч перед визуализацией с использованием Fugene6 (Promega). Клетки, используемые для визуализации живых клеток, высевали на покровные стекла (CS-5R; Warner Instruments), покрытые 10 мкг / мл фибронектина в среде Leibovitz L15, без фенолового красного (21083027; Thermo Fisher Scientific), содержащей 5% FBS. Система была настроена и работала, как описано ранее (Chen et al., 2014).

Образцы освещали при 37 ° C с помощью диодного лазера с длиной волны 445 нм (Oxxius) при 60% пропускании акустооптического перестраиваемого фильтра и начальной мощности лазера 50 мВт (2.75 мкВт в задней фокальной плоскости), и 488-нм диодный лазер (MPB Communications) с 30% акустооптическим перестраиваемым пропусканием фильтра, начальной мощностью 30 мВт (4,71 мкВт в задней фокальной плоскости), последовательно сканируемых на пространственном модуляторах света (Дисплеи четвертого измерения) и фокусировались через возбуждающий объектив (водная иммерсия 0,65 NA; специальная оптика). Эмиссию флуоресценции собирали детекторным объективом (CFI Apo LWD 25XW, 1.1 NA; Nikon) и детектировали на sCMOS-камерах (Hamamatsu Orca Flash 4.0 v2). Функции рассеяния точки для каждой длины волны возбуждения были экспериментально измерены с использованием 200-нанометровых тетраспековых шариков, приклеенных к 5-миллиметровому стеклянному покровному стеклу (T7280; Invitrogen), в качестве прямого измерения светового полотна и оптического качества. Всего 12 клеток из трех временных курсов были получены в два отдельных дня: 180 временных точек, 8,12 с на объем клетки, общее время 24,2 мин; 120 временных точек, 8,12 с на объем ячейки, общее время 16,1 мин; и 90 временных точек, 7,96 с на объем ячейки, общее время 11,8 мин. Для работы с прибором и сбора данных использовалось программное обеспечение LabView (National Instruments).

Обработка биосенсора требует нескольких вычислительных шагов, которые различаются в зависимости от рассматриваемого биосенсора, настройки визуализации и плана эксперимента. Чтобы справиться с этими различными обстоятельствами, был разработан модульный сценарий обработки биосенсора, который позволяет пользователю выбирать дополнительные этапы обработки по мере необходимости (или добавлять дополнительные этапы, если требуется). Кроме того, данные из каждого модуля хранятся до тех пор, пока они не будут специально изменены, что позволяет пользователю сосредоточиться на данном шаге процесса без необходимости пересчитывать предыдущие шаги.Эта схема управления данными облегчает быстрое изучение очень больших наборов данных. Скрипты состоят из модулей для организации необработанных данных, коррекции плоского поля, регистрации изображения, вычитания фона / коррекции фотообесцвечивания, сегментации, сквозной коррекции, а также визуализации и анализа биосенсора. Обратите внимание, что Apple не поддерживает видеокарты NVIDIA в своей новейшей операционной системе MacOS 10.14. Эта проблема с драйвером повлияет на некоторые функции 3D-рендеринга ImageTank на старых компьютерах.Затронутые компьютеры включают некоторые модели 2013 года выпуска и одну модель 2014 года, однако эти компьютеры не пострадают при работе с MacOS 10.13 или более ранней версии.

Мы благодарим Национальные институты здравоохранения (R35GM122596 и R01HL133668) и Министерство обороны США (W911NF-15-1-0631 / A16-0438-001) за их поддержку. Центр усовершенствованной визуализации совместно спонсируется Медицинским институтом Говарда Хьюза и Фондом Гордона и Бетти Мур.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Вклад авторов: Э. К. О’Шонесси создал биосенсор Rap1 и возглавил экспериментальную работу. E.S. Витчен и К. Берридж внесли свой вклад в тестирование биосенсора на живых клетках. К.М. Хан инициировал и руководил проектом. E.C. О’Шонесси, Д. Адальстейнссон, К.М. Хан написал статью при участии всех авторов. Д. Адальштейнссон написал программу при содействии P.K. ЛаФосса и при участии К. Хан и Э.К. О’Шонесси. T.L. Чу и Дж.М.Хеддлстон предоставили прибор LLSM в Центре усовершенствованной визуализации Janelia Farm и помогли там проводить эксперименты. W.R. Legant проводил исследования LLSM в лаборатории Betzig вместе с E.C. O’Shaughnessy и M.L. Азоитей, под руководством Э. Бетцига. О.Дж. Стоун и М. Азоитей провел начальные исследования биосенсоров, а D.Цыганков осуществил начальную разработку программного обеспечения и подхода к анализу данных.

Babraham Bioinformatics — Public Projects Скачать

Загрузить проекты Babraham Bioinformatics

Весь код Babraham Bioinformatics выпущен под лицензией GNU General общественная лицензия. Вы должны знать, что некоторые из загрузки на этой странице включают код из других проектов, который доступны на разных условиях лицензии.

Все проекты Babraham Bioinformatics распространяются БЕЗ КАКИХ-ЛИБО ГАРАНТИЙ; даже без подразумеваемых гарантий ТОВАРНОЙ ПРИГОДНОСТИ или ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ ОСОБЕННАЯ ЦЕЛЬ.

Если у вас возникли проблемы с любым из загруженных вами программ отсюда тогда пожалуйста, сообщите нам о них, и мы сделаем мы делаем все возможное, чтобы разобраться с ними.

Если вы хотите быть в курсе изменений в наших существующих проектах или с новое программное обеспечение, которое мы выпустили, тогда вы можете Следуйте за нами на Twitter Вы также можете увидеть демонстрации нашего программного обеспечения на нашем Канал YouTube 1

ASAP Выполнение аллель-специфических выравниваний в образцах секвенирования следующего поколения со смешанным генетическим фоном

Bareback Инструмент для перетасовки последовательности низкой сложности до конца секвенирования Illumina

Bismark Бисульфитный преобразователь чтения и вызывающая программа метилирования

ChIPMonk Инструмент для анализа чипов на кристалле

Инструмент командной строки потока кластера для конвейеров биоинформатики в кластере

Compter Анализ и визуализация композиции последовательности

Трекер различий Трекер слабых движущихся частиц

FastQC Приложение контроля качества для данных последовательности с высокой пропускной способностью

FastQ Screen Приложение для скрининга данных последовательности с высокой пропускной способностью

Программа просмотра изображений FocalPoint

FRETSaw Программа просмотра изображений FRET

HiCUP конвейер для анализа данных Hi-C

Лабрадор Инструмент для управления и автоматизации обработки общедоступных наборов данных

mzViewer mzData Viewer

Инструмент нормализации ПЦР в реальном времени Realyser

Инструмент для точечной печати с возможностью перенастройки точек

reStrainingOrder Идентификация штамма мыши / гибрида

Инструмент анализа отображенных последовательностей SeqMonk

Обработанный бисульфитом Sherman Read FastQ Simulator

Sierra Простая система LIMS для секвенирования

SNPsplit Аллель-специфическое выравнивание, сортировка для N-замаскированных геномов

Подключаемый модуль SparkSpotter ImageJ для определения событий Spark

Плагин StackMeasure ImageJ для определения и измерения характеристик изображений

Trim Galore Постоянное качество и обрезка адаптера для файлов RRBS или стандартных файлов FastQ

Развитие сенсора киназы FRET выявляет активацию SnRK2 / OST1 посредством ABA, но не посредством MeJA, и высокий уровень CO2 во время закрытия устьиц

В растениях протеинкиназы SnRK2 играют решающую роль в реакциях на абиотический стресс (Boudsocq and Laurière, 2005; Umezawa et al., 2009; Накашима и др., 2009; Fujita et al., 2009; Fujii and Zhu, 2009; Ли и др., 2000; Йошида и др., 2002; Mustilli et al., 2002). Активация протеинкиназ SnRK2 абсцизовой кислотой необходима для передачи сигнала ABA (Cutler et al., 2010; Raghavendra et al., 2010; Zhu, 2016). Однако обычный метод анализа киназы SnRK2 в геле имеет значительные ограничения для мониторинга типа клеток, клеточного компартмента и зависящей от времени активации этих протеинкиназ. Анализы киназы в геле в замыкающих клетках Arabidopsis требуют очистки 10 ⁵ или более протопластов замыкающих клеток из более чем 100 листьев и 10 растений для каждой отдельной замыкающей клетки. Полоса анализа киназы в геле .Измерения FRET в реальном времени активности протеинкиназы SnRK2 в интактных отдельных растительных клетках и тканях с использованием репортера SNACS позволяют напрямую исследовать ключевые биологические вопросы в реальном времени, как показано здесь.

В данном исследовании мы разработали датчик протеинкиназы SnRK2, SNACS, содержащий субстратный домен AKS1 и полноразмерный белок 14-3-3. Киназа SnRK2.6 / OST1 фосфорилировала сенсор SnRK2 в зависимости от остатка AKS1 Ser-30 in vitro (рис. 1C), который необходим для связывания с белком 14-3-3 при передаче сигнала ABA (Takahashi et al., 2013). Анализы in vitro и in planta показывают увеличение отношения FRET в зависимости от активности киназы SnRK2 (Фигуры 1D, E и 5). Мы также наблюдали индуцированное АБК увеличение соотношения FRET в эпидермальных клетках Nicotiana benthamiana и замыкающих клетках Arabidopsis (рисунки 2 и 3). Фосфорилирование остатка AKS1 Ser-30 необходимо для связывания белка 14-3-3 с белком AKS1 (Takahashi et al., 2013). Примечательно, что мутантная изоформа сенсора AKS1 Ser-30-Ala не обнаруживает изменений соотношения FRET как in vitro, так и в растительных клетках (Фигуры 1F и 4).Эти результаты согласуются с моделью, в которой изменения в соотношении FRET происходят из конформационных изменений в результате связывания белка 14-3-3 с фосфорилированным доменом AKS1 в SNACS (рис. 1B). Полноразмерный белок AKS1 функционирует как фактор транскрипции в ядре. Однако домен bHLH AKS1, который важен для его функции транскрипционного фактора и ядерной локализации, был исключен из нашей сенсорной конструкции SNACS. Флуоресценция SNACS, по-видимому, наблюдается в основном в цитоплазме и в цитоплазматических пространствах между вакуолями, с возможной слабой экспрессией или отсутствием экспрессии в ядре (Рисунок 3 — Приложение к рисунку 1).Будущие исследования могут нацелить SNACS на ядро или другие клеточные компартменты.

ABA вызвало относительно небольшие сдвиги отношения SNACS FRET в замыкающих ячейках. Слепые эксперименты с контрольной обработкой ABA против EtOH и контроли с мутантными SNACS ^S785A и snrk2.2 / 2.3 / 2.6 тройными мутантными замыкающими клетками подтвердили ABA-ответ SNACS (рисунки 3, 4 и 5). Были разработаны сенсоры протеинкиназы для протеинкиназ, которые показывают небольшие сдвиги соотношения от 1% до 4% и используются для решения ключевых биологических вопросов (например,g.Kajimoto et al., 2019). В нашем исследовании средний ответ SNACS на АБК составил 3,7 ± 0,2% (n = 46 устьиц, ± SEM). Низкий фоновый шум в этих датчиках киназ позволил проводить анализ активации и ингибирования киназ в реальном времени (Kajimoto et al. , 2019). Следовательно, из-за небольших сдвигов соотношений, непрерывные записи в отдельных клетках необходимы для разрешения зависимых от стимулов изменений FRET (Allen et al., 1999), вместо того, чтобы исследовать сравнение соотношений FRET в разных клетках за один момент времени.Получение изображений FRET с помощью SNACS позволяет получать изображения отдельных типов клеток в режиме реального времени по сравнению с необходимостью очистки очень большого количества клеток и выделения экстрактов для каждой полосы анализа киназы в геле .

Ингибитор протеинкиназы K252a, который, как известно, нарушает передачу сигналов ABA в замыкающих клетках (Schmidt et al., 1995), ингибирует индуцированное ABA увеличение FRET (рис. 6A). Кроме того, тройные мутанты snrk2.2 / 2.3 / 2.6 не показали явного изменения отношения FRET, индуцированного АБК (рис. 5D). Эти данные предполагают, что изменения соотношения FRET, вызванные ABA, зависят от фосфорилирования белка (рис. 1C).Интересно, что мы также обнаружили, что K-252a вызывает уменьшение отношения SNACS FRET, когда K252a применялся после увеличения отношения FRET, индуцированного ABA (Рисунок 6C). Это согласуется с дефосфорилированием SNACS протеинфосфатазой в растительных клетках. Мы не исключаем возможность того, что K252a влияет на активность другой протеинкиназы в дополнение к активности SnRK2 (Рисунок 6 — рисунок в приложении 1). Ингибитор кальмодулина, который не ингибирует SnRK2.6 / OST1, не влиял на соотношения флуоресценции SNACS (Рисунок 6E; Рисунок 6 — рисунок в приложении 1).В ost1 / snrk2.6 одинарных мутантных замыкающих клетках и в snrk2.2 / snrk2.3 двойных мутантных замыкающих клетках АБК вызывала увеличение отношения FRET в SNACS, но не в snrk2.2 / 2.3 / 2.6 тройные мутантные замыкающие клетки (рис. 5). Кроме того, SNACS-зависимые сигналы FRET были обращены ингибиторами протеинкиназы (рис. 6). Вместе эти данные предполагают, что SNACS может сообщать о низкой базовой активности SnRK2, и что SNACS может динамически сообщать о биологических изменениях активности. HAB1 (также называемый AtP2C-HA) (Chérel et al., 2002; Саез и др., 2004; Leonhardt et al., 2004), протеинфосфатаза типа 2C, участвующая в трансдукции сигнала ABA, по-видимому, не дефосфорилирует остаток Ser-30 фактора транскрипции AKS1 (Takahashi et al., 2017). Фосфатазы PP2A могут дефосфорилировать AKS1 (Bu et al., 2017). K252a-индуцированное снижение соотношения SNACS FRET в замыкающих клетках свидетельствует о том, что репортер SNACS является обратимым. Потенциальная обратимость SNACS предполагает, что динамическую повышающую и понижающую регуляцию протеинкиназ SnRK2 можно исследовать в интактных растительных клетках в режиме реального времени.

Метилжасмонат (MeJA) — это растительный гормон, который участвует во многих процессах развития и важен для защитных реакций растений (Melotto et al., 2017). Однако MeJA, по-видимому, вызывает разные результаты регуляции устьиц в зависимости от условий. MeJA-опосредованное закрытие устьиц наблюдалось у нескольких видов, включая Paphiopedilum (Gehring, 1997), Vicia faba (Liu et al., 2002) и Arabidopsis (Suhita et al., 2004; Hossain et al., 2011). ; Munemasa et al., 2007; Munemasa et al., 2019; Инь и др., 2016; Förster et al., 2019). Однако в других исследованиях сообщалось, что MeJA не способствует закрытию устьиц (Montillet et al., 2013; Savchenko et al., 2014; Melotto et al., 2017; Zhu et al., 2020). Кроме того, протеинкиназа SnRK2.6 / OST1 необходима для MeJA-индуцированного закрытия устьиц из-за нарушенной MeJA-индуцированной реакции закрытия устьиц у мутантов snrk2.6 / ost1 (Yin et al., 2016). Кроме того, анализы киназы в геле для эпидермальных тканей, обогащенных замыкающими клетками, предполагают, что MeJA не активирует SnRK2.6 / OST1, хотя мутация OST1 / SnRK2.6 нарушает вызванное MeJA закрытие устьиц (Munemasa et al., 2019). В настоящем исследовании репортер SNACS не показал явного увеличения соотношений FRET в замыкающих клетках при применении 20 мкМ MeJA, что согласуется с данным исследованием с использованием эпидермальных тканей, обогащенных замыкающими клетками (Munemasa et al., 2019; Рисунок 7). Эти данные могут поддерживать недавно предложенный кальций-зависимый параллельный путь ответа MeJA (Förster et al., 2019). Сообщенный здесь датчик SNACS может быть использован для дальнейшего исследования передачи сигналов MeJA в различных условиях.

High CO ₂ и ABA запускают быстрое закрытие устьиц. Исследования газообмена, движения устьиц и регуляции ионных каналов с использованием мутантных аллелей ost1 показали, что протеинкиназа SnRK2.6 / OST1 играет роль в закрытии устьиц, индуцированном CO ₂ (Xue et al., 2011; Merilo et al. , 2013; Hsu et al., 2018). Однако неожиданно результаты анализа киназы в геле показали, что повышение уровня CO ₂ не усиливает активность SnRK2.6 / OST1 в протопластах замыкающих клеток, даже несмотря на то, что высокий уровень CO ₂ активировал анионные каналы S-типа в той же системе (Hsu и другие., 2018). Однако оставалось неясным, может ли повышенный CO ₂ активировать активность протеинкиназы SnRK2 в живых интактных замыкающих клетках. В настоящем исследовании мы использовали новый репортер SNACS для изучения передачи сигнала CO ₂ в интактных замыкающих клетках устьиц. Анализ FRET с временным разрешением в замыкающих клетках показывает, что повышение CO ₂ не вызывает измеримого увеличения отношения FRET для замыкающих клеток, экспрессирующих SNACS, тогда как последующее воздействие ABA вызывает явное увеличение отношения FRET (рис. 8A и B), что свидетельствует о в интактных замыкающих клетках этот высокий CO ₂ не активирует SnRK2.6 / ОСТ1 активность.

Исследования показали, что рецепторы ABA и OST1 / SnRK2.6 необходимы для закрытия устьиц дикого типа, такого как высокий уровень CO ₂ (Chater et al., 2015; Xue et al., 2011; Hsu et al., 2018 ). Классические исследования показали, что нестрессированные замыкающие клетки имеют более высокую концентрацию АБК, чем другие клетки листа (Lahr and Raschke, 1988), и совсем недавно это было показано экспериментально (Hsu et al., 2018; Yoshida et al., 2019). Для объяснения всех экспериментальных наблюдений была выдвинута гипотеза об основной активности киназы SnRK2 в нестрессированных замыкающих клетках (Hsu et al., 2018). Однако прямые измерения базальной активности SnRK2 в замыкающих клетках оказались невозможными. Интересно, что ингибитор протеинкиназы K252a вызывал явное снижение соотношения FRET репортера SNACS, а K252a ингибировал ABA-индуцированные изменения FRET в SNACS в замыкающих клетках (фиг. 6A и D). Кроме того, индуцированный ABA ответ SNACS нарушается у тройного мутанта snrk2.2 / 2.3 / 2.6 (рис. 5D). Эти данные предоставляют экспериментальные доказательства того, что протеинкиназы SnRK2 обладают базальной киназной активностью в замыкающих клетках даже в отсутствие экзогенного применения АБК.Обнаруженная здесь базальная активность SnRK2 может объяснить, почему мутантные аллели ost1 / snrk2.6 явно нарушены в индуцированном CO ₂ закрытии устьиц (Xue et al., 2011; Hsu et al., 2018; Merilo et al. ., 2013), но повышенный уровень CO ₂ не увеличивает активность OST1 / SnRK2.6 (Рисунок 8): Настоящие данные предполагают, что базальная активность SnRK2, функционирующая параллельно ветви передачи сигнала CO ₂, необходима для и / или может усилить сигнализацию CO ₂.Более того, закрытие устьиц, вызванное высоким CO ₂, замедляется, но не нарушается в ost1 / snrk2.6 (Hsu et al., 2018). Это контрастирует с более сильным ABA-нечувствительным ответом ost1 / snrk2.6 мутантных аллелей (Mustilli et al., 2002; Yoshida et al., 2002). Эти данные согласуются с параллельной ролью ABA и OST1 в передаче сигнала CO ₂.

Недавнее исследование показало, что передача сигнала CO ₂ опосредуется PYL4 и PYL5, но не рецепторами PYL2 ABA (Dittrich et al., 2019). Этот вывод не может быть подтвержден в настоящем исследовании с использованием пятерых и шестерых мутантных растений по рецептору АВА более высокого порядка, которые включают нарушения генов PYL4 и PYL5 (Рисунок 9, Рисунок 9 — дополнение к рисунку 1, Рисунок 9 — приложение к рисунку 2 и Рисунок 9 — дополнение к рисунку 3). В настоящем исследовании пять линий разрушения рецептора ABA pyl-11458 и pyl-12458 были исследованы на газообмен в Dittrich et al., 2019. Однако данные для линий комплементации замыкающих клеток, представленные здесь, были основаны на pyl-11458 , тогда как данные по газообмену в Dittrich et al., 2019 были основаны на дополнении pyl-12458 . Уровни экспрессии белков трансгенно экспрессируемых рецепторов могут варьироваться, влияя на интерпретацию. Таким образом, использование линий разрушения генов в настоящем исследовании позволяет сделать более надежные выводы и демонстрирует, что закрытие устьиц, вызванное CO ₂, остается устойчивым после разрушения PYL4 и PYL5 (рисунок 9 и рисунок 9 — приложение к рисунку 1). Кроме того, количественные различия в уровнях экспрессии белков трансгенно экспрессируемых рецепторов ABA в замыкающих клетках и условиях роста могут влиять на результат данных устьичного ответа, учитывая актуальность найденных здесь базальных концентраций ABA и активности SnRK2.Большая скорость транспирации в пятерном мутанте pyl-12458 была снижена за счет экспрессии замыкающих клеток PYL5 (дополнительная фигура 8C в Dittrich et al., 2019), что можно объяснить ответом на базальную АБК. В соответствии с этой моделью, мы наблюдали замедленное открытие устьиц в pyl-11458 / PYL5 листьях (Рисунок 9 — рисунок в приложении 2D). Устьичные ответы на высокий уровень CO ₂ были затронуты и замедлены у мутантов рецептора АВА pyr / pyl / rcar более высокого порядка (Hsu et al., 2018). Однако данные для комплементации с отдельными рецепторами (Dittrich et al., 2019) могут зависеть от условий роста, поскольку настоящие независимые результаты наших двух лабораторий (EM и HK lab и JS lab) и предыдущих исследований (Merilo et al., 2013 ; Hsu et al., 2018) не могут подтвердить модель, согласно которой PYL4 и PYL5 опосредуют устьичный ответ на CO ₂.

Нормализация часто используется для отображения устьичных ответов мутантов с сильно различающейся устойчивой устьичной проводимостью.Обратите внимание, что помимо сравнения зависимости устьичных ответов от времени, выводы, сделанные на основе интерпретации данных нормализованной устьичной проводимости, могут быть неоднозначными. Мутанты, которые реагируют на стимуляцию, но имеют более высокую устьичную проводимость и сохраняют более высокую устьичную проводимость после реакции (что может быть связано с развитием устьиц и отверстиями), могут демонстрировать очевидное снижение чувствительности, когда данные нормализуются до значений до начала стимул. Например, в настоящем исследовании анализ нормализованных данных устьичной проводимости привел бы к неточным выводам: например, когда анализировались данные устьичной проводимости с Рисунка 9, но в нормализованных относительных единицах, то есть путем деления абсолютного снижения устьичной проводимости на устьичная проводимость в начале повышенного CO ₂, выводы, противоположные анализу ненормализованных данных, могут быть сделаны (Рисунок 9 — рисунок в приложении 1): после нормализации шестиместный мутант PYR / RCAR и пятерка pyl-11458 мутант имел наименьшее нормализованное снижение устьичной проводимости в ответ на повышение CO ₂ (Рисунок 9 — рисунок в приложении 1).Однако, в отличие от тех же данных, абсолютные значения устьичной проводимости показывают самые сильные ответы CO ₂ у рецептора ABA pyl-12458 пятерки и pyl-112458 шестикратных мутантов (рис. 9A и B, рис. 9 — рис. приложение 1). Эти анализы показывают, что для количественного определения чувствительности устьиц линий растений с разной начальной устьичной проводимостью к стимулам необходимо применять различные кинетические анализы, основанные на ненормированных устьичных проводимости в реальном времени.Отображение как абсолютных, так и нормализованных данных рядом (Hsu et al., 2018) или предоставление значений устьичной проводимости в установившемся состоянии может помочь в разработке более надежных механистических моделей.

В заключение, SnRK2 являются ключевыми протеинкиназами, которые опосредуют реакции на абиотический стресс. В совокупности представленное исследование обеспечивает новый подход к изучению активности киназы SnRK2 в реальном времени и стрессовых реакций в живых интактных клетках и тканях растений. Репортер SNACS можно использовать для исследования многих моделей передачи сигналов стресса и перекрестных помех между путями (Yoshida et al., 2006; Wang et al., 2018; Такахаши и др., 2020; Lin et al., 2020). Более того, субклеточное нацеливание на SNACS д. Быть интересным для будущих сравнений регуляции протеинкиназы SnRK2, локализованной в клеточных компартментах. Кроме того, мы представляем доказательства обратимости SNACS in vivo при ингибировании активности киназы, предполагая, что также можно проанализировать подавление протеинкиназы SnRK2. Более того, как повышенный уровень CO ₂, так и MeJA не вызывали увеличения коэффициента испускания флуоресценции SNACS, что дает экспериментальные доказательства того, что эти стимулы не усиливают быстро SnRK2.6 / активность OST1 в замыкающих клетках, как обнаружено здесь при анализе в реальном времени. Более того, наши анализы газообмена в интактных растениях и листьях не могут подтвердить недавно предложенную модель, согласно которой устьичная передача сигналов CO ₂ требует рецепторов PYL4 и PYL5 ABA (Dittrich et al.

LADA Granta Cross 2021 года: фото, цены, комплектации, характеристики

известна дата производства — журнал За рулем

Lada XRAY Cross

Lada XRAY Cross

Lada XRAY Cross

Чем порадует АвтоВАЗ в 2020 году («Российская газета»)

Новая LADA Vesta SW Cross в салоне дилера

Qualcomm представила 5G-модем нового поколения Snapdragon X65 со скоростью до 10 Гбит/с

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Основные принципы FRET

Факторы, влияющие на измерения FRET

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Чувствительное излучение

Акцептор фотообесцвечивания

Флуоресцентная микроскопия для непрерывной визуализации (FLIM)

Спектральная визуализация

Обработка изображений поляризационной анизотропии

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

Выводы

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Что сохраняется в файлах cookie?

Interbase FRET в РНК: от А до Я | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

ВВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РНК УФ-плавление и круговой дихроизм

Измерения флуоресценции

А-форма

Z-образная форма

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез tC

Тест FRET А-формы РНК

Форма от A до Z FRET

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

ФИНАНСИРОВАНИЕ

ССЫЛКИ

Заметки автора

Интернет-кампус ZEISS Microscopy | FRET-микроскопия со спектральной визуализацией

Введение

Свойства пар флуоресцентных белков для спектральной визуализации FRET

Таблица 1

Babraham Bioinformatics — Public Projects Скачать

Загрузить проекты Babraham Bioinformatics

ASAP Выполнение аллель-специфических выравниваний в образцах секвенирования следующего поколения со смешанным генетическим фоном

Bareback Инструмент для перетасовки последовательности низкой сложности до конца секвенирования Illumina

Bismark Бисульфитный преобразователь чтения и вызывающая программа метилирования

ChIPMonk Инструмент для анализа чипов на кристалле

Инструмент командной строки потока кластера для конвейеров биоинформатики в кластере

Compter Анализ и визуализация композиции последовательности

Трекер различий Трекер слабых движущихся частиц

FastQC Приложение контроля качества для данных последовательности с высокой пропускной способностью

FastQ Screen Приложение для скрининга данных последовательности с высокой пропускной способностью

Программа просмотра изображений FocalPoint

FRETSaw Программа просмотра изображений FRET

HiCUP конвейер для анализа данных Hi-C

Лабрадор Инструмент для управления и автоматизации обработки общедоступных наборов данных

mzViewer mzData Viewer

Инструмент нормализации ПЦР в реальном времени Realyser

Инструмент для точечной печати с возможностью перенастройки точек

reStrainingOrder Идентификация штамма мыши / гибрида

Инструмент анализа отображенных последовательностей SeqMonk

Обработанный бисульфитом Sherman Read FastQ Simulator

Sierra Простая система LIMS для секвенирования

SNPsplit Аллель-специфическое выравнивание, сортировка для N-замаскированных геномов

Подключаемый модуль SparkSpotter ImageJ для определения событий Spark

Плагин StackMeasure ImageJ для определения и измерения характеристик изображений

Trim Galore Постоянное качество и обрезка адаптера для файлов RRBS или стандартных файлов FastQ

Развитие сенсора киназы FRET выявляет активацию SnRK2 / OST1 посредством ABA, но не посредством MeJA, и высокий уровень CO2 во время закрытия устьиц

Добавить комментарий Отменить ответ