Лада фото: Официальный сайт LADA

Таблица 1

Недавнее расширение цветовой палитры флуоресцентных белков для создания вариантов, обладающих широким спектром спектральных профилей, в сочетании с усложнением конструкции белковых химер (слияния, а также биосенсоры) привело к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые являются потенциально полезно в экспериментах FRET (см. Таблицу 1).Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция, как кратко обсуждается выше), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком. Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках.Методы измерения FRET

В связи с тем, что практически все комбинации флуорофоров, используемые для мониторинга FRET, затруднены отдельными и часто уникальными проблемами, которые усложняют их применение для этого метода, для исследователя критически важно полностью понять методологию, в соответствии с которой FRET используется. измеряется. Исследователи должны использовать как можно больше различных методов измерения при проведении пилотных экспериментов с новыми комбинациями FRET с биологическими последствиями.После того, как система была настроена, а результаты согласованы и хорошо поняты, простейшие экспериментальные подходы могут быть использованы для дополнительных измерений. Несмотря на то, что для измерения FRET было разработано большое количество методов, многие из них очень сложны и требуют оборудования, которого нет в большинстве центров микроскопии керна. Наиболее практичные подходы к измерению FRET ограничиваются несколькими методами, которые будут рассмотрены ниже.

Высокая степень спектрального перекрытия между профилями излучения донора и поглощения акцептора, необходимая для FRET, также создает значительный уровень фонового шума, который может существенно мешать обнаружению сигналов FRET.Как обсуждалось ранее, спектральное просвечивание, возможно, является основной проблемой при разделении сигналов FRET для анализа. И донор, и акцептор обычно вносят свой вклад в просачивание, которое может быть обнаружено в канале FRET. Просачивание от донора происходит из-за перекрытия профилей излучения флуоресценции донора и акцептора, которые часто очень широкие (более 100 нанометров) и их трудно разделить. Напротив, просачивание из акцептора происходит в результате прямого возбуждения акцепторных флуорофоров освещением, которое используется для возбуждения донора и образования FRET.Большое количество других источников шума также может испортить измеряемый сигнал FRET. К ним относятся автофлуоресценция, детектор микроскопа и оптический шум, а также вариации спектральной чувствительности в донорных и акцепторных каналах. В результате наиболее полезный подход к измерению точных сигналов FRET требует применения методологии, которая может либо избежать, либо успешно удалить загрязняющие фоновые сигналы.

«утечки сигнала» можно в значительной степени избежать, используя методы FRET, такие как фотообесцвечивание акцептора (также обычно называемое декухшингом донора ; см. Рисунок 5) и микроскопию визуализации времени жизни флуоресценции ( FLIM ), но эти методы также могут вводить другие ограничения.Метод фотообесцвечивания акцептора используется для определения эффективности FRET путем измерения величины подавленного донорного сигнала (рис. 5 (а)) в присутствии акцептора с последующим измерением ослабленного донорного сигнала после того, как флуоресценция акцептора была разрушена посредством фотообесцвечивание (рис. 5 (б) и 5 ​​(в)). Основная концепция фотообесцвечивания акцептора FRET заключается в том, что флуоресценция донора тушится в результате резонансной передачи энергии акцептору. В результате фотообесцвечивание акцептора увеличивает флуоресценцию донора из-за потери эффекта тушения.Таким образом, если FRET происходит между донором и акцептором, флуоресценция донора должна увеличиваться, когда акцептор эффективно удаляется после фотообесцвечивания. Одним из преимуществ фотообесцвечивания акцепторов является то, что каждая исследуемая клетка служит своим собственным контролем, что делает этот метод одним из самых точных для измерения FRET.

Основная задача при выполнении измерений FRET фотообесцвечивания акцептора заключается в том, чтобы убедиться, что донор также не подвергается фотообесцвечиванию, и что акцептор фотообесцвечивается (по крайней мере) примерно до 10 процентов от его первоначального значения.Любое фотообесцвечивание донора приведет к недооценке эффективности FRET из-за потери сигнала. Кроме того, поскольку акцептор необратимо фотообесцвечивается (фактически разрушается), методика фотообесцвечивания акцептора не может быть повторена на одной и той же ячейке. Кроме того, из-за высокой фотостабильности, которую демонстрируют многие флуоресцентные белки, фотообесцвечивание акцептора может занять несколько минут и менее полезно для динамических измерений в живых клетках. Измерения фотообесцвечивания акцептора также могут быть скомпрометированы, если вся ячейка не будет отбелена за один этап.Фотообесцвечивание выбранной области цитоплазмы позволяет притоку свежих флуорофоров в обесцвеченную область, что увеличивает время, необходимое для обесцвечивания всех акцепторных молекул в клетке. Помимо этих проблем, фотообесцвечивание акцептора по-прежнему широко используется для определения эффективности FRET и обеспечивает отличный контроль после проведения экспериментов, основанных на альтернативных методах.

Мониторинг времени жизни донорной флуоресценции в экспериментах FRET можно использовать, чтобы избежать многих проблем, часто встречающихся при методах фотообесцвечивания акцепторов.FLIM, пожалуй, самый строгий метод, используемый для измерения FRET, и он менее склонен к просачиванию артефактов, поскольку измеряет только колебания флуоресценции донора. Все флуорофоры, включая флуоресцентные белки, демонстрируют экспоненциальное затухание их флуоресцентного излучения, которое можно измерить в наносекундной шкале времени. Скорость этого экспоненциального затухания чувствительна к любым процессам, влияющим на возбужденное состояние, включая множество переменных окружающей среды, которые могут гасить флуоресценцию.Таким образом, основная концепция, связанная с FLIM, связана с фотообесцвечиванием акцептора в том смысле, что его можно использовать для обнаружения изменений времени жизни донорной флуоресценции, которые сопровождают передачу энергии акцептору. Фактически, флуоресценция донора гасится FRET, и степень этого гашения может быть определена путем измерения изменений времени жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора.

Комбинация FLIM с FRET может облегчить проблемы с артефактами прямого возбуждения акцептора, которые усложняют другую методологию, и этот метод также можно использовать для мониторинга FRET с использованием акцепторов, которые сами по себе не являются флуоресцентными.Однако у FLIM есть ограничения, которые не позволяют ему стать самым популярным методом для получения изображений FRET. Главное соображение заключается в том, что наносекундные измерения срока службы чрезвычайно сложны и должны проводиться с использованием дорогостоящих приборов, которые не являются широко доступными. Кроме того, FLIM часто требуется несколько минут для сбора каждого изображения, что сильно ограничивает его применение для быстрых динамических событий. Еще одно осложнение — это многоэкспоненциальные кривые спада времени жизни, которые обычно встречаются у многих флуорофоров, которые обычно требуют более всеобъемлющих стратегий сбора данных и усложняют анализ FRET.Наконец, измерения FLIM чувствительны к факторам окружающей среды за пределами FRET, которые могут сократить измеряемый срок службы, включая автофлуоресценцию, вязкость, изменения pH и присутствие ионов металлов. Все только что описанные переменные снижают эффективность использования только методов акцепторного фотообесцвечивания и FLIM, однако они представляют собой важные средства контроля для проверки измерений FRET, полученных другими методами.

Самый простой и простой метод измерения FRET известен как сенсибилизированное излучение (в литературе обычно называется двухцветным ратиометрическим изображением ; см. Рисунок 6), который может быть выполнен на стандартном широкоугольном микроскопе, оборудованном соответствующей флуоресценцией. наборы фильтров.При сенсибилизированной эмиссии донорный флуорофор возбуждается определенной полосой длин волн, и сигнал собирается с использованием двух наборов эмиссионных фильтров, настроенных на флуоресценцию донора или акцептора. Этот метод может дать результаты очень быстро (ограниченный только ограничениями переключения колес фильтров) и поэтому весьма полезен при динамической визуализации живых клеток. В том маловероятном случае, когда не происходит просачивания между возбуждением и испусканием двух флуорофоров, сенсибилизированное излучение будет преобладающим методом измерения FRET.К сожалению, просачивание обычно является значительной проблемой, особенно при использовании флуоресцентных белков, а сенсибилизированное излучение требует обширных контрольных экспериментов, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Кроме того, эти элементы управления должны подвергаться значительной обработке изображения, чтобы вычесть проступание, ограничение, которое замедляет время сбора данных, увеличивает уровень шума и вносит относительно высокую степень неопределенности в измерения.

На рис. 6 представлена ​​серия изображений, полученных при широкоугольном флуоресцентном освещении кальциевых волн, проходящих через цитоплазму клеток карциномы человека ( HeLa ), экспрессирующих циркулярно пермутированный вектор камелеона YC3.60. Этот биосенсор содержит варианты ECFP и EYFP, которые содержат белок кальмодулин и кальций-кальмодулин-связывающий домен киназы легкой цепи миозина ( M13 ) в линейной химере. В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками. На рисунке 6 (а) представлено реальное цветное изображение двух соседних клеток перед добавлением гистамина для индукции связывания кальция с биосенсором.На рисунках с 6 (b) по 6 (h) показаны изображения в псевдоцветном соотношении кальциевых волн, распространяющихся через цитоплазму двух клеток HeLa. Обратите внимание, что волна распространяется сверху вниз в верхней ячейке и справа налево в нижней ячейке. Общее время прохождения кальциевой волной цитоплазмы в этих клетках составляло приблизительно 1,5 секунды. Уровень FRET указывается путем сравнения логометрических псевдоцветов с легендой, представленной на рисунке 6 (а). Изображения на рисунке 6 были получены с использованием двухдиапазонного дихроматического светоделителя, соединенного с фильтрами возбуждения и излучения, настроенными на оптимальные диапазоны длин волн для визуализации ECFP и EYFP с минимальным просачиванием.

Был описан ряд корректирующих подходов для сенсибилизированного излучения с использованием нескольких различных комбинаций фильтров с контролями, которые содержат только донор, только акцептор или образец FRET как с донором, так и с акцептором. Элементы управления позволяют исследователю определить уровень просачивания возбуждения и излучения и вычесть его из измерения FRET. Однако из-за всех необходимых поправочных коэффициентов количество шума в окончательном FRET-изображении может превышать уровень сенсибилизированного излучения в ситуациях, когда взаимодействие между донором и акцептором является слабым.Спектральная визуализация в измерениях FRET

В приложениях FRET построение спектральных изображений можно рассматривать как разновидность метода сенсибилизированного излучения, основанного на возбуждении только донора с последующим получением всего спектра излучения как донорной, так и акцепторной флуоресценции вместо сбора данных по двум независимым каналам. До появления лазерных сканирующих конфокальных микроскопов, предназначенных для получения спектральных изображений, методика в основном ограничивалась спектроскопическими экспериментами с использованием кювет и очищенных флуорофоров.Спектральная визуализация FRET предполагает, что сбор всего спектра флуоресценции позволит разделить перекрывающиеся спектральные профили в соответствии с различными формами спектров, а не просто контролировать интенсивность излучения в ограниченной области полосы пропускания с использованием фильтра. Таким образом, собирая весь спектр как от донора, так и от акцептора (см. Рисунок 7 (a)), можно с помощью спектральной визуализации определить уровни флуоресценции донора и акцептора и на основе этой информации (в сочетании с контролями) вычислить эффективность FRET.

На фиг. 7 представлено логометрическое измерение спектральной визуализации для флуоресцентного белкового биосенсора кальция, известного как cameleon YC3.60, как описано выше. Спектральные профили YC3.60 в присутствии (красная кривая; рис. 7 (а)) и отсутствии (желтая кривая) кальция демонстрируют высокий динамический диапазон зонда при 530 нанометрах. Мультяшные рисунки биосенсора Cameleon представлены в присутствии (Рисунок 7 (b)) и в отсутствие (Рисунок 7 (c)) кальция, чтобы проиллюстрировать, как щелочной металл вызывает конформационные изменения в M13, чтобы переместить две флуоресцентные белковые части ближе друг к другу. .Лямбда-стек изображений с 10-нанометровыми интервалами клеток, экспрессирующих камелеон в присутствии высокой концентрации кальция, показан на рисунке 7 (d). Обратите внимание, что самые высокие интенсивности наблюдаются для лямбда-плоскости, содержащей длины волн излучения от 530 до 540 нанометров.

Сравнение спектрального изображения с линейным несмешиванием и сенсибилизированного излучения с двумя длинами волн возбуждения для определения FRET показывает, что отношение сигнал / шум для методов сенсибилизированного излучения ниже, чем у спектрального изображения (хотя это не всегда так и зависит от сильно зависит от параметров и конфигурации прибора).Это несоответствие связано с тем, что фильтры излучения с относительно узкой полосой пропускания, необходимые для отделения излучения от близко перекрывающихся флуорофоров, блокируют большинство используемых фотонов, которые в противном случае обнаруживаются с помощью спектральной визуализации. Отказ от большого количества выбросов приводит к значительной потере информации, которая в некоторых случаях приближается к 50 процентам имеющихся данных. Кроме того, спектральная визуализация обеспечивает оптимальное взвешивание в соответствии с шумом, присутствующим в отдельных каналах данных, в отличие от традиционных методов (часто произвольно отбрасываемых).Спектральная визуализация требует предварительного определения уровня просачивания из-за прямого возбуждения акцептора, но метод может выиграть от использования двух длин волн возбуждения с инструментами, которые так оснащены.

для получения спектральных изображений, оснащенные акустооптическими перестраиваемыми фильтрами ( AOTF, ) и специализированными детекторными системами, могут использоваться для получения серии изображений в дискретных ограниченных диапазонах длин волн для генерации так называемых лямбда-сумм (изображения боковых ( x, y ) как функция длины волны).Спектральные сигнатуры ( эмиссионных отпечатков пальцев, ) для отдельных флуорофоров или флуоресцентных белков и загрязняющих фоновых сигналов (таких как автофлуоресценция) получают в результате деконволюции стэков лямбда. Метод линейного несмешивания может быть применен к лямбда-сумме для разделения вкладов отдельных сигналов флуорофора в каждый пиксель полученного изображения. Таким образом, спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием может определять и устранять вклад просачивания донора в сигнал FRET.Однако из-за того факта, что флуоресцентное излучение, вызванное прямым возбуждением акцептора (называемое просачиванием акцептора, см. Выше), идентично по спектральным характеристикам сигналу флуоресценции, производимому FRET, необходимо разработать элементы управления, которые помогают определить и устранить вклад акцепторного просачивания, чтобы получить эффективность FRET. Спектральную визуализацию также можно комбинировать с фотообесцвечиванием акцептора или использовать для изучения динамических изменений эффективности FRET в флуоресцентных белковых биосенсорах без использования контроля.Последняя стратегия, пожалуй, наиболее широко применяемый метод исследования FRET с помощью спектральной визуализации.

Для устранения просвечивающего излучения акцептора из-за перекрестного возбуждения в приложениях FRET для получения спектральных изображений большинство подходов основано на предположении, что при отображении в идентичных условиях динамика этих артефактов будет по существу одинаковой в контрольных ячейках, которые экспрессируют только акцептор (по сравнению с экспериментальными клетками, которые экспрессируют как донор, так и акцептор).Однако из-за того, что разные ячейки используются для определения вклада проступания в экспериментальных ячейках, отдельные местоположения пикселей нельзя сравнивать напрямую. В большинстве случаев можно сравнить пиксели как в контрольных, так и в экспериментальных клетках, которые имеют совпадающие уровни флуоресценции. Этот метод основан на алгоритме, который определяет уровни флуоресценции пиксель за пикселем и устанавливает уровень проступания в контрольных клетках, которые экспрессируют только акцептор.Эти контрольные значения проступания затем применяются в качестве поправочного коэффициента к соответствующим совпадающим пикселям в экспериментальных ячейках, которые выражают как донорные, так и акцепторные флуорофоры.

В парах FRET флуоресцентных белков, которые сконструированы с вариантами голубого и желтого флуоресцентных белков (ECFP и EYFP), для получения спектрального изображения требуется возбуждение голубого варианта с использованием лазерной спектральной линии, которая перекрывается с профилем поглощения флуоресцентного белка. В современных конфокальных микроскопах используются диодные и газовые лазеры со спектральными линиями 405, 440 и 458 нанометров, каждый из которых полезен для возбуждения голубых флуоресцентных белков.Однако спектральная линия длиной 458 нм от аргон-ионного газового лазера приводит к значительному просачиванию акцептора (примерно 20 процентов) в канал FRET для пар ECFP-EYFP. Напротив, диодные лазеры с длиной волны 405 и 440 нм будут генерировать меньше проступания (примерно 4 и 8 процентов, соответственно), но загрязняющий сигнал от прямого акцепторного возбуждения все равно должен быть удален для точного расчета сигнала FRET. После установления соотношения интенсивностей изображения донора в присутствии ( I _DA ) и отсутствии ( I _D ) акцептора эффективность FRET может быть определена с помощью следующего соотношения:

E _FRET = 1 — (I _DA / I _D )

Расчет эффективности FRET таким образом был подтвержден с использованием пар флуоресцентных белков FRET, которые были слиты вместе с короткими пептидными линкерами, а также гораздо более сложной задачи исследования FRET между зондами, которые экспрессируются отдельно.Результаты показали очень похожие значения эффективности FRET при сравнении спектральной визуализации с методологией на основе интенсивности и FLIM. Однако спектральная визуализация позволяет избежать потенциальных проблем, связанных с просачиванием акцепторного сигнала в донорный канал, что является обычным явлением для сенсибилизированной эмиссии на основе фильтров и визуализации с многофотонным возбуждением. Следует обратить внимание на то, что компонент спектрального просвечивания акцептора часто является незначительным и может создавать проблемы при количественной оценке уровня сигнала при использовании детекторов с фотоумножителями, которые имеют нестабильный отклик при очень низких значениях интенсивности.Этот артефакт можно преодолеть, определив просачивание на разных уровнях интенсивности в контрольных ячейках.

Перекрестного возбуждения акцептора можно избежать, выбирая пары FRET флуоресцентного белка, у которых есть донор с большим стоксовым сдвигом. Например, mT-Sapphire и mAmetrine являются производными GFP, которые поглощают свет в ультрафиолетовых длинах волн (примерно 400 нанометров), но излучают либо в зеленой (510 нанометров), либо в желтой (530 нанометров) областях спектра.Когда эти доноры соединены с оранжевыми или красными флуоресцентными акцепторами белка, возбуждение пары FRET вызывает скудное просачивание акцептора и не требует поправочных факторов или контролей. Например, соединение производной GFP, известной как GFP2, с EYFP привело к образованию пары FRET, которую можно возбудить с помощью диодного лазера с длиной волны 405 нм и успешно наблюдать с помощью спектральной визуализации. Поскольку GFP2 и EYFP имеют сильно перекрывающиеся спектры излучения, линейное разделение данных FRET позволяет определить вклад каждого флуорофора в общее излучение флуоресценции.Аналогичным образом, связывание мАметрина с тандемно-димерным томатом (tdTomato) дает пару FRET, которая излучает оранжево-красную флуоресценцию при возбуждении на 405 нм. Возбуждение только tdTomato на этой длине волны практически не дает детектируемого сигнала, поэтому при использовании этой пары поправка на просачивание акцептора не требуется. Подобные пары FRET, вероятно, дадут идентичные результаты.

Из-за неспособности конфокальной микроскопии спектральной визуализации различать эмиссионный сигнал акцептора, генерируемый посредством FRET, и сигнал, происходящий от прямого возбуждения акцептора в флуоресцентном белке и других парах флуорофоров, которые имеют сильно перекрывающиеся спектральные профили, необходимые для FRET, несколько исследователей объединили спектральная визуализация с использованием методов фотообесцвечивания акцепторов для определения эффективности FRET.На рисунке 8 показан пример спектральной визуализации флуоресцентных белков с фотообесцвечиванием акцептора для анализа FRET. Флуорофор представляет собой химеру mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. При экспрессии в клетках млекопитающих (почки кролика) вектор слияния распространяется по цитоплазме и проникает в ядро. Спектральное изображение выраженного вектора в клетках, полученное от 450 до 650 нанометров, представлено на рисунке 8 (а), а изображения эмиссии mCerulean и mVenus с разрешенным спектром показаны на рисунках 8 (b) и 8 (c), соответственно.После фотообесцвечивания mVenus в ячейке, показанной в нижней части окна светом 514 нанометров (Рисунок 8 (f)), флуоресцентное излучение mCerulean увеличивается (Рисунки 8 (d) и 8 (e)) как следствие донорства. обезвоживание.

Фотообесцвечивание акцептора обычно достигается с помощью лазерной спектральной линии, которая перекрывает область с высоким коэффициентом экстинкции (как можно ближе к пику) в спектре поглощения акцептора. Например, в комбинации ECFP-EYFP FRET для фотообесцвечивания EYFP обычно используется 514-нанометровая аргонно-ионная лазерная линия, тем самым уменьшая гашение ECFP с последующим увеличением донорного сигнала (рисунки 8 (d) -8 (f)).Поскольку EFYP постепенно фотообесцвечивается, лямбда-сканирование спектрального изображения проводится с использованием 548-нанометровой линии аргон-ионного лазера (возбуждающего ECFP) между каждым событием фотообесцвечивания для регистрации изменений спектрального отклика. Как правило, лямбда-пакеты собираются в диапазоне длин волн от 465 до 600 нанометров в дискретных полосах пропускания (приблизительно 10 нанометров). Этот экспериментальный подход разработан для минимизации ошибки отдельных измерений путем подгонки изменений интенсивности к стандартной кривой.Значения максимального увеличения интенсивности ECFP можно затем экстраполировать из этой кривой, даже если EYFP никогда не подвергается фотообесцвечиванию полностью. Конечная цель — избежать повреждения живых клеток и нежелательного фотообесцвечивания ECFP в ходе эксперимента. Методы фотообесцвечивания акцептора дают оптимальные результаты, когда донор является фотостабильным, а акцептор — фотолабильным. Эту ситуацию можно контролировать, выбирая подходящие варианты флуоресцентного белка, такие как Cerulean и Venus.

Чтобы рассчитать эффективность FRET с использованием метода фотообесцвечивания акцептора, необходимо выполнить ряд шагов в стратегии анализа данных. Первый шаг состоит из линейного разделения компонентов ECFP и EYFP (или других флуорофоров, если они используются вместо них). Затем за измерением средней интенсивности доноров ECFP и акцепторов EYFP следует расчет изменений интенсивностей для определения эффективности FRET. После получения стопок лямбда используется линейное размешивание для создания изображений донора ECFP и акцептора EYFP из стопок.Общий успех линейного разделения зависит от наличия образцов, которые демонстрируют хорошее отношение сигнал / шум, и использования эталонных спектров, которые точно представляют спектры, содержащиеся в образце FRET. В большинстве случаев клетки, экспрессирующие только ECFP или EYFP (контроль), используются для генерации эталонных спектров. Контрольные спектры должны быть получены в тех же условиях, что и для образца FRET, включая настройки усиления, смещение, диапазон длин волн, объектив и дихроматическое зеркало. Изображения должны быть получены с минимальной насыщенностью сигнала и минимальной интенсивностью пикселей, установленной чуть выше нуля, чтобы получить максимально возможный динамический диапазон.После вычитания фона эффективность FRET рассчитывается с использованием приведенного выше уравнения, где ( I _DA ) и ( I _D ) представляют собой нормированные интенсивности донора до и после 100-процентного фотообесцвечивания акцептора. В связи с тем, что EYFP почти никогда не обесцвечивается полностью, значение для ( I _D ) обычно экстраполируется из линейной аппроксимации графика, описывающего процентное увеличение выбросов ECFP по сравнению с процентным уменьшением EYFP.Технику фотообесцвечивания акцептора можно использовать с другими парами флуоресцентных белков (такими как EGFP и mKusabira Orange) аналогичным образом.

Уникальный подход к измерению FRET с помощью спектральной визуализации получил название lambda FRET и оказался высокоспецифичным, чувствительным и надежным методом анализа резонансной передачи энергии в живых клетках. Алгоритм лямбда FRET основан на отображении образца FRET на нескольких длинах волн излучения с последующим разделением спектра FRET на его донорные и акцепторные компоненты для получения пиксельного расчета эффективности FRET.Lambda FRET применяет новую процедуру предварительной калибровки для коррекции спектрального просвечивания, основанную на получении эталонных отраженных изображений, и была подтверждена с использованием синтетических флуорофорных стандартов FRET (таких как Alexa Fluor 488 и Cy3), а также слияния флуоресцентных белков. (ECFP и EYFP) с переменной длиной линкера и стехиометрией. Уникальная процедура коррекции, основанная на использовании отраженных изображений для нормализации для различной интенсивности излучения, в принципе аналогична методам сенсибилизированного излучения, но дает результаты с меньшим шумовым загрязнением.Было продемонстрировано, что лямбда FRET может быть полезен в случаях, когда высокое спектральное перекрытие и артефакты автофлуоресценции присутствуют как в сценариях визуализации фиксированных, так и живых клеток.

Помимо изучения межмолекулярных взаимодействий и определения эффективности FRET с использованием методов фотообесцвечивания акцепторов и коррекции просвечивания, спектральная визуализация оказалась очень полезной для исследования флуоресцентных белковых биосенсоров для определения наличия или отсутствия FRET в ответ на биологический стимул. .Методология требует получения спектра биосенсора в присутствии и в отсутствие стимулятора, чтобы определить, наблюдается ли FRET или нет, и контролировать динамический диапазон ответа (см. Рисунок 7). Таким образом, творчески объединив пары флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов или другой биологической активности, ряд исследователей разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для визуализации важных оптических живых клеток. метаболические и сигнальные процессы.Обычно два флуоресцентных белка (обычно голубой и желтый варианты) вставляются на противоположных концах сенсорного белка или пептидной последовательности (см. Фиг. 9), как кратко описано выше. Изменения конформации сенсорного белка вызывают соответствующие третичные изменения в структурной организации комплекса и, таким образом, в уровне FRET, который может наблюдаться между фланкирующими флуоресцентными белками. Ратиометрическое изменение выхода флуоресценции донора и акцептора с использованием одного параметра возбуждения в сочетании со спектральной визуализацией становится популярной методологией для исследования этих биосенсоров.

На рисунке 9 представлена ​​карикатура, иллюстрирующая общие стратегии построения флуоресцентных белковых биосенсоров. Голубые цилиндры представляют собой CFP, серые цилиндры представляют собой YFP без FRET, а желтые цилиндры представляют YFP с FRET. Синие молнии указывают на возбуждение на 450 нм, а параллельные волны — на флуоресцентное излучение (на 475 нм, голубой; или 530 нм, желтый). Сенсорные домены имеют телесный цвет, а эффекторные агенты — сферы или эллипсы. На рисунке 9 (a) показан межмолекулярный FRET между отдельным сенсорным доменом и субстратом, слитым с CFP и YFP, соответственно, а на рисунке 9 (b) изображен флуоресцентный белковый биосенсор с одним сенсорным доменом и эффекторным лигандом.Связывание субстрата с сенсорным доменом на рисунке 9 (a) вызывает FRET, тогда как связывание лиганда на рисунке 9 (b) вызывает конформационные изменения в сенсорном домене, чтобы привести флуоресцентные белки в правильную близость для передачи энергии (см. Также Рисунки 7 (б) и 7 (в)). В некоторых случаях домены субстрата и сенсорного белка связаны (рисунок 9 (c)) для создания единой генетической единицы экспрессии для внутримолекулярного FRET, в отличие от ситуации на рисунке 9 (a). Флуоресцентный белковый биосенсор, который обнаруживает расщепление субстрата (рис. 1 и рис. 9 (d)), работает путем устранения FRET после того, как соответствующая протеаза была индуцирована.Биосенсоры протеазного расщепления являются популярными индикаторами апоптоза.

За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих различные пары FRET. Несмотря на ограничения динамического диапазона, наблюдаемые в некоторых биосенсорах FRET, использующих производные голубого и желтого цветов, использование этих флуоресцентных белков получило широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений, широкой доступности и простоты сравнения с другими датчиками, имеющими аналогичные свойства. .Начинают появляться альтернативные пары FRET, включая голубые и бирюзовые донорные флуоресцентные белки, связанные с желтыми и оранжевыми акцепторными флуоресцентными белками, а также зеленые флуоресцентные доноры белков, связанные с красными флуоресцентными белками-акцепторами. Однако на сегодняшний день полезность флуоресцентных белков, полученных из рифовых кораллов и морских анемонов, ограничена. Несколько многообещающих биосенсоров сопоставляют сапфировое или желтое производное GFP с красным флуоресцентным белком для получения репортера длинного стоксова сдвига, как обсуждалось выше.Без сомнения, появятся усовершенствованные биосенсоры, использующие более точно настроенные комбинации флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов. С этой целью спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием будет по-прежнему рассматривать увеличение нагрузки как один из методов выбора для анализа FRET.

Выводы

Ряд методов был разработан для анализа FRET в флуоресцентных белках, а также в синтетических красителях и квантовых точках.Для визуализации живых клеток спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием обеспечивает надежный метод измерения FRET с использованием флуорофоров с сильно перекрывающимися спектральными профилями, что обычно встречается с образцами FRET. Новые флуоресцентные белковые биосенсоры обещают расширить горизонты динамических исследований субклеточной активности, и спектральная визуализация должна оказаться очень полезным инструментом в этой области. Для дальнейшего совершенствования аналитических методов спектральную визуализацию можно комбинировать с методами фотообесцвечивания на протяжении всего срока службы или акцептора.Кроме того, возможность проведения экспериментов FRET с использованием двух разных акцепторов (имеющих разные спектры излучения) находится в пределах области спектральной визуализации, но гораздо труднее выполнять с использованием традиционной методологии.

FRET-повышенная фотостабильность позволяет улучшить отслеживание отдельных молекул белков и белковых комплексов в живых клетках млекопитающих

Анализ структуры белка

Данные опубликованных кристаллических структур были проанализированы с использованием пакета UCSF Chimera ⁵⁵ .Программное обеспечение Chimera также использовалось для создания рисунков для этой статьи. Список проанализированных белковых структур выглядит следующим образом: mEos3.2 (PDB ID: 3P8U) ⁵⁶ , HaloTag (PDB ID: 4KAA) ⁵⁷ , тег SNAP (PDB ID: 3KZZ) ⁵⁸ и CENP -Нуклеосома (PDB ID: 3AN2) ⁴⁴ .

Экспрессия белков mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP-tag

Конструкция mEos3.2-HaloTag была клонирована из плазмид, содержащих mEos3.2 ⁵⁹ и HaloTag (Promega), слитых через короткий линкер (Leu- Glu-Gly-Ser), и вставляли в расщепленный EcoRI / HindIII экспрессионный вектор pET30a с использованием набора для клонирования In-Fusion HD (Clontech).Таким же образом клонировали конструкцию HaloTag-SNAP. Затем проводили сайт-направленный мутагенез вектора mEos3.2-HaloTag для создания слитой конструкции с другой длиной линкера (ΔARRELEGSE).

His-tagged конструкции mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP были экспрессированы в клетках E. coli BL21 (DE3) pLysS путем выращивания литра клеток из 50-мл заквасочной культуры до OD _{600 нм} 0,7–1,0 в среде LB, содержащей 35 мкг / мл канамицина и 34 мкг / мл хлорамфеникола, перед индукцией экспрессии с использованием 1 мМ IPTG (Melford Laboratories Ltd) в течение 4 ч при 25 ° C.Клетки осаждали и хранили при -20 ° C. Для очистки белка клетки быстро размораживали при 37 ° C и ресуспендировали в трех объемах буфера для лизиса (50 мМ Hepes pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5% глицерин и коктейль ингибиторов протеазы (Roche)) на объем осадка. Затем ресуспензию клеток обрабатывали ультразвуком в течение 13 минут с амплитудой 33% (5 секунд при включении и 10 секунд после выключения) с использованием Sonic Dismembrator (модель 505, Fisher Scientific), остатки клеток осаждали, собирали лизат белка и фильтровали через фильтр 0,45- мкм фильтр.

Слитые белки сначала очищали с помощью аффинной хроматографии на никеле. Белковый лизат ресуспендировали в 5 мл суспензии шариков 50% Ni-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA) (Qiagen), предварительно уравновешенной в буфере (50 мМ NaH ₂ PO ₄ , 300 мМ NaCl, pH 8,0) и вращали в течение ночи при 4 ° C. Слитый белок очищали с использованием гравитационной колонки объемом 20 мл (Bio-Rad), промывали тремя объемами колонки промывочного буфера (50 мМ NaH ₂ PO ₄ , 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазол, pH 8.0) и, наконец, элюировали 10 мл буфера для элюирования (50 мМ NaH ₂ PO ₄ , 1 М NaCl, 250 мМ имидазол, pH 8,0). Затем белок диализовали (в 50 мМ NaH ₂ PO ₄ , 1 М NaCl, pH 8,0) для удаления имидазола с использованием Vivaspin 500 с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) 5 кДа (Sartorius Stedim Biotech). Затем гибридный белок очищали гель-фильтрацией в буфере, состоящем из 50 мМ NaH ₂ PO ₄ и 1 М NaCl (колонка 75 мл Sephadex200, GE Healthcare).Для проверки массы белка (65096,8 Да) проводили масс-спектрометрию, а для определения его концентрации использовали аминокислотный анализ. Белок хранили в аликвотах по 500 мкл с концентрацией 1 мг / мл при -80 ° C и повторно очищали с использованием эксклюзионной хроматографии перед маркировкой красителя. Слитые белки (5–10 мкМ) метили лигандами HaloTag-dye или SNAP tag-dye путем их реакции в эквимолярном соотношении при комнатной температуре в течение 1 ч перед очисткой с использованием гравитационной колонки Illustra Nap-5 (GE Healthcare ).Масс-спектрометрия подтвердила, что метка близка к 100%.

Красители HaloTag или SNAP-tag PA-JF ₅₄₉ и JF ₆₄₆ были любезным подарком от Люка Д. Лависа (HHMI) ⁶⁰ .

Характеристика спектров объемной флуоресценции

Спектры объемной флуоресценции были получены с использованием mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉ с красителем JF ₆₄₆ или без него (15–25 мкМ) с использованием флуоресцентного спектрофотометра (Cary Eclipse). Образец помещали в кварцевую кювету (Hellma Analytics, 3 × 3 мм).Чтобы определить фактическую эффективность FRET белков mEos3.2-HaloTag с различными красителями, спектры излучения были собраны после возбуждения при 532 нм и регистрации флуоресценции в диапазоне длин волн (550-800 нм). Эффективность FRET ( E ) была рассчитана по стандартному уравнению (уравнение 1):

$$ E = 1 — \ frac {{I _ {\ rm D} \ prime}} {{I _ {\ rm D}} }, $$

где \ (I _ {\ rm D} \) — интенсивность флуоресценции одного донорного флуорофора (mEos3.2), а \ (I _ {\ rm D} \ prime \) — интенсивность флуоресценции донор в присутствии акцептора (mEos3.2 \) — фактор ориентации диполя (\ (\ frac {2} {3} \) для свободно вращающихся донорных и акцепторных флуорофоров), \ (Q _ {\ rm D} \) — квантовый выход донора mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉ флуорофоров (0,55 и 0,88 соответственно), n — показатель преломления среды (1,33), а J — интеграл спектрального перекрытия между донорами mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉ и акцепторный JF ₆₄₆ спектры, рассчитанные для разных длин волн λ с использованием коэффициента экстинкции \ ({\ it {\ epsilon}} _ {\ rm A} \) акцепторного красителя JF ₆₄₆ (максимальное значение 152000 M ⁻¹ см ⁻¹ ) (Ур.4 \ mathrm {d} \ lambda. $$

Визуализация времени жизни флуоресценции

Измерения временного коррелированного подсчета одиночных фотонов (TCSPC) были выполнены на системе Leica SP8 STED 3x, дополнительно оснащенной программным обеспечением Single Molecule Detection (SMD) (SymPhoTime версия 5.3.2.2) и оборудование (PicoHarp 300; PHR 800) от PicoQuant. Возбуждение флуоресценции в этой системе осуществлялось с помощью импульсного (80 МГц) настраиваемого лазера белого света (WLL; Super-K; NKT Photonics), в то время как обнаружение флуоресценции осуществлялось с помощью внутреннего гибридного детектора одиночных молекул (Leica HyD SMD).Возбуждение донора осуществляли на длине волны 561 нм с полосой обнаружения 570-620 нм и с использованием водно-иммерсионного объектива 20 × 0,75 NA (HC PL APO CS2) с коэффициентом масштабирования 1 × и скоростью сканирования 400 Гц. , и с накоплением кадров 25 изображений. Фотоактивация / преобразование достигались с использованием лазера 405 нм в течение 1 мин при мощности активации 1,75 кВт / см. ² в фокальной плоскости объектива до измерения срока службы. Увеличение эмиссии доноров произошло после активации / конверсии, как и ожидалось.Измерения FLIM проводили в трех экземплярах до и после активации / конверсии очищенного белка в 50 мМ NaH ₂ PO ₄ , 1 М NaCl, pH 8,0 на 8-луночных μ-предметных стеклах со стеклянным дном (iBidi). Белок прикрепляли к покровному стеклу путем инкубации с поли-L-лизином (Sigma Aldrich) в течение 30 минут, а затем с 5–10 мкМ белка в течение 10 минут. Буфер был заменен, чтобы удалить плавающий белок, а затем визуализация прикрепленного белка была проведена путем фокусирования на покровном стекле. Присоединение было подтверждено визуализацией, чтобы гарантировать, что фотопреобразованные молекулы не диффундируют с течением времени.

Данные о распаде TCSPC после активации / преобразования анализировали с использованием программного обеспечения SymPhoTime (версия 2.1) от Picoquant. В этом анализе мы проанализировали хвост совокупных данных распада TCSPC для всех пикселей изображения с минимальным числом 50 фотонов и с необработанным временным диапазоном 1,5 нс ≤ τ ≤ 7,0 нс. Кривая затухания была подобрана к сумме кривых экспоненциального затухания хвоста, определенных (уравнение 5):

$$ {\ mathrm {I (t)}} = I _ {\ mathrm {Bkgd}} {\ mathrm {+} } \ mathop {\ sum} \ limits_i \ alpha _ie ^ {- t / \ tau _i} $$

где I _Bkgd — смещение интенсивности для подсчета фона, а \ (\ alpha _i \) и \ (\ tau _i \) — значения амплитуды и времени жизни для и -й экспоненты, где мы сравнивали аппроксимации для 1 ≤ и ≤ 3 (т.е.е., моно-, би- и трехэкспоненциальные аппроксимации). Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных с помощью байесовского информационного критерия (BIC) ^62,63 . Короче говоря, используя этот подход, мы вычислили BIC для каждой модели из (Ур. 6)

$$ \ mathrm {BIC} = \ ln [n] (p + 1) + n \ left ({\ ln \ left [{\ frac {{2 \ pi {\ rm RSS}}} {n}} \ right] + 1} \ right), $$

, где n — количество точек данных, p — это количество свободных параметров для подгонки, а RSS — остаточная сумма квадратов подбора.Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных из (Уравнение 7):

$$ {\ mathrm {Relative}} \; {\ mathrm {Likelihood}} = {\ mathrm {Exp}} \ left [{ \ frac {{{\ mathrm {BIC}} _ ​​{{\ mathrm {Min}}} {\ mathrm {(модель) -}} {\ mathrm {BIC (модель)}}}} {2}} \ right] . $$

Данные для mEos3.2 с JF ₆₄₆ и без него и PA-JF ₅₄₉ с JF ₆₄₆ и без него можно описать двумя временами жизни. Мы определили эффективность FRET ( E ), используя среднее время жизни флуоресценции (уравнение.8):

$$ E = 1 — \ frac {{\ tau _ {{\ rm DA}}}} {{\ tau _ {\ rm D}}}, $$

где \ (\ tau _ {\ rm D} \) — средневзвешенное по амплитуде время жизни флуоресценции одного донорного флуорофора (mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉ ), а \ (\ tau _ {{\ rm DA}} \) — амплитуда средневзвешенное время жизни флуоресценции донора в присутствии акцептора (mEos3.2 – JF ₆₄₆ или PA-JF ₅₄₉ –JF ₆₄₆ ).

Установка микроскопа

В этой работе использовались две сделанные на заказ установки микроскопа, обе из которых описаны ниже.Таблицу с подробным описанием конкретных параметров, используемых для каждого эксперимента, можно найти в дополнительной информации.

Микроскоп 1: использовался инвертированный микроскоп IX71 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре масляного объектива Olympus 1,49 NA 60 × (Plan Apochromat 60 × NA 1,49, Olympus APON 60XOTIRF). Используемые источники света диодных лазеров с непрерывной длиной волны включают 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Oxxius, LaserBoxx 405, 100 мВт).Полное внутреннее отражение достигалось смещением лазерного луча от оси таким образом, чтобы выходящий луч на границе образца был почти коллимированным и падал под углом, превышающим критический угол θ _c ~ 67 ° для границы раздела стекло / вода для Визуализация TIRF и немного меньше θ _c для визуализации с косоугольным освещением. Это создавало след возбуждения диаметром ~ 50 мкм. Для TIRF плотность мощности на покровном стекле для лазера 561 нм была рассчитана приблизительно равной 0.4 кВт / см ² измерено с помощью лазерного луча при эпи-освещении. Для косоугольного освещения мощность коллимированных лучей на задней апертуре микроскопа составляла 10 кВт / см ² и 10–100 Вт / см ² для лазерных лучей 561 нм и 405 нм соответственно. Лазеры отражались дихроичными зеркалами, которые также отделяли собранное флуоресцентное излучение от пучка TIR (Semrock, Di01-R405 / 488/561/635). Эмиссия флуоресценции собиралась через тот же объектив, а затем дополнительно фильтровалась с использованием комбинации длиннопроходных и полосовых фильтров (BLP01-561R и FF01-587 / 35 для возбуждения 561 нм).Эмиссионный сигнал расширялся с помощью расширителя ахроматического луча 2,5 × (Olympus, PE 2,5 × 125) и, наконец, проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512) с усилением электронного умножения 250 ADU / фотон, работающим в режиме передачи кадров. Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ ^64,65 .

Микроскоп 2: использовался инвертированный микроскоп IX73 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре Olympus 1.40 NA 100 × масляный объектив (Universal Plan Super Apochromat, 100 ×, NA 1.40, UPLSAPO100XO / 1.4). Используемые диодные лазерные источники света с непрерывной длиной волны включают 641 нм (когерентный, CUBE 640–100 C, 100 мВт), 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Stradus, Toptica, 405–100, 100 мВт). Визуализация TIRF и косоугольного освещения выполнялась с использованием идентичных дихроичных зеркал и эмиссионных фильтров. Сигнал излучения проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512 Delta) с усилением электронного умножения 250 ADU / фотон, работающий в режиме передачи кадров.Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ ^64,65 .

TIRF-характеристика красителей mEos3.2-HaloTag

Покровные стекла из боросиликатного стекла (VWR Int, 22 × 22 мм) очищали для удаления любых флуоресцентных остатков в очистителе аргоновой плазмы (плазма Харрика) в течение 1 часа. Камеры для инкубации с герметичной рамкой (Bio-rad) прикрепляли к покровному стеклу и 50 мкл 0,1% поли-L-лизина (Sigma Aldrich) добавляли в центр камеры на 30 мин; Затем к покровному стеклу, покрытому поли-L-лизином, добавляли 50 мкл 10 нМ белка на 10-15 мин.Образец трижды промывали 50 мкл фильтрованной (шприц-фильтр 0,2 мкм, Whatman, 6780–1302) воды MilliQ, и изображения флуоресценции, собранные в виде видеозаписей из 500 изображений, при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование производилось одиночным импульсом в первом кадре каждого фильма.

Анализ фотофизических параметров

Эксперимент был воспроизведен в лаборатории дважды на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2. Хотя все эксперименты показали схожие результаты, мы решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить возникающие систематические ошибки. от слегка различающихся настроек микроскопа.Мы проанализировали фильмы, собранные в тот же день с микроскопа 1, в которых мы отслеживали 455 и 454 отдельных молекул mEos3.2 и mEos3.2 – JF ₆₄₆ без Trolox, 990 и 1568 отдельных молекул mEos3.2 и mEos3.2 – JF ₆₄₆ молекул с 2 мМ Trolox. Учитывая, что 20% одиночных молекул mEos3.2 – JF ₆₄₆ находились во включенном состоянии значительно дольше, чем одиночные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Все гистограммы были созданы с использованием пакета Origin (OriginLab, Northampton, MA).

Здесь приводится краткое описание программного обеспечения, используемого для анализа данных. Проекция с максимальной интенсивностью первых двух изображений после фотопреобразования использовалась в качестве основы для обнаружения одиночных молекул. К проекции был применен фильтр Лапласа гаусса, и были найдены локальные максимумы. Скрипты для этого доступны на https://github.com/TheLaueLab/blob-detection, а для всех остальных шагов — на https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis. Область с центром на каждом пике с пороговым значением> 600 ADU была извлечена из каждого изображения.Эта область состояла из области сигнала 7 на 7 пикселей и окружающей фоновой области шириной 2 пикселя. Отдельные кадры были упрощены до одномерных трасс путем вычитания среднего покадрового фона из соответствующего кадра, а затем взятия среднего значения всех пикселей в этом кадре. Скрытая марковская модель (с использованием пакета python hmmlearn из https://github.com/hmmlearn/hmmlearn) была настроена с четырьмя состояниями: двумя включенными состояниями, одним выключенным и одним обесцвеченным. Переходы были одинаково вероятны между всеми включенными и выключенными состояниями и 1/10 вероятности из любого включенного состояния в обесцвеченное состояние (переход от обесцвеченного состояния был невозможен).Состояния были инициализированы со средним значением 300 ADU для включенного состояния и 0 для выключенного и обесцвеченного состояний, с предварительным весом 1e3, присвоенным среднему состоянию. Модель была обучена на всех следах от определенного флуорофора, и та же обученная модель использовалась для категоризации всех следов.

Общее время в открытом состоянии каждой молекулы было рассчитано путем подсчета количества изображений в открытом состоянии. Мигание было определено как серия последовательных изображений; средняя длина цикла, умноженная на время воздействия, представляет собой время включения, а количество циклов, обнаруженных для конкретной молекулы, представляет собой количество событий переключения.Частота выключения — это количество миганий, разделенное на общее время включения, а скорость включения — это количество миганий, разделенное на общее время выключения (исключая последний запуск вне кадра, если он продолжался до конец видео).

Наконец, было вычислено полное излучение фотонов для каждого изображения, вычитая среднее значение области фона из области сигнала. Чтобы рассчитать количество испускаемых фотонов на молекулу, общее усиление камеры в аналого-цифровых единицах (ADU) / фотон было определено по формуле (Ур.9)

$$ G _ {{\ rm total}} = \ frac {1} {{G _ {{\ rm camera}}}} \ times G _ {{\ rm EM}} \ times {\ rm QE}, $$

где G _камера — это усиление сигнала, присущее EMCCD в единицах ADU / электрон, G _EM — это соотношение заряда камеры с усилением и без него, а QE — это коэффициент усиления. квантовая эффективность — способность камеры производить заряд в результате падающего фотона с единицами электронов / фотонов. G _итого это 33.1 ADU / фотон и 35,7 ADU / фотон для микроскопов 1 и 2 соответственно.

Измеренный сигнал ( I ) в единицах электронов был преобразован в испускаемые фотоны ( n ) следующим образом (уравнение 10):

$$ n = \ frac {I} {{G _ {{\ rm total}} \ times {\ rm TE}}}. $$

TE определяется как эффективность передачи всех оптических компонентов на пути излучения прибора и может быть описана формулой (11)

$$ { \ rm TE} = \ eta _ {{\ rm coll}} \ times T \ times \ eta _ {{\ rm EMCCD}}, $$

, где η _coll — эффективность сбора объективом, T — это пропускание внутренних оптических компонентов микроскопа, а η _EMCCD — квантовая эффективность EMCCD ⁶⁶ .

Культура клеток млекопитающих и генерация клеточной линии

ES-клетки культивировали в стандартных условиях сывороточного и мышиного фактора ингибирования лейкемии (mLIF): минимальная необходимая среда Глазго (Sigma-Aldrich G5154), содержащая 100 мМ 2-меркаптоэтанол (Life tech, кат. 21985023), 1 × Minimum Essential Media, незаменимые аминокислоты (Sigma-Aldrich, M7145), 2 мМ L-глутамин (Life tech, кат. 25030024), 1 мМ пируват натрия (Sigma-Aldrich, S8636-100ML), 10% фетальная бычья сыворотка (HyClone FBS, номер партии SZB20006, GE Healthcare Austria SV30180.03) и 10 нг / мл mLIF (предоставлено кафедрой биохимии Кембриджского университета). Их пассировали каждые 2 дня, промывая PBS (Sigma-Aldrich, D8537), добавляя 0,25% трипсин-ЭДТА (Life tech, кат. 25200072) для отделения клеток, а затем промывая в среде перед повторным посевом в свежую среду. Чтобы помочь клеткам прикрепиться к поверхности, планшеты инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,1% желатина (Sigma Aldrich, G1890). Фоновые линии ES-клеток E14tg2a (доступные от Sigma Aldrich, 08021401) были охарактеризованы с помощью количественной ПЦР, RNA-seq, ChIP-seq и анализов активности, и их обычно проверяли на контаминацию микоплазмой и дали отрицательный результат.

ES-клетки, экспрессирующие мышиный CHD4, помеченный на С-конце mEos3.2-HaloTag, генерировались путем нокаута на основе CRISPR / Cas9 кассеты, содержащей mEos3.2-HaloTag и ген селекции пуромицина в один аллель CHD4 клетки ES ³⁷ . Затем кассету пуромицина удаляли с использованием рекомбиназы Dre для генерации аллеля CHD4 с помощью слияния с С-концевым mEos3.2-HaloTag. Поскольку нокаут CHD4 является летальным, мы использовали анализы жизнеспособности клеток, чтобы убедиться, что функция меченого CHD4 не пострадала.Линия ES-клеток E14tg2a ⁶⁷ , экспрессирующая mEos3.2-tagged CENP-A, была ранее описана ⁵⁹ , но вкратце была создана путем трансфекции плазмиды, экспрессирующей меченый белок, с последующим отбором в 500 мкг / мл генетицина (Life tech , кат.10131019). После 2 недель отбора генетицина клетки сортировали с использованием проточного сортировщика MoFlo (Beckman Coulter), чтобы гарантировать, что они были помечены флуорофором mEos3.2 (возбуждение при 488 нм, испускание при 515 нм). Чтобы проверить наличие одномолекулярного FRET между mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉ и JF ₆₄₆ на разных белках, векторы, экспрессирующие CENP-A с тегами HaloTag и SNAP, были созданы путем вставки последовательности тегов HaloTag или SNAP в сайт NcoI / XhoI mEos3.2. -меченый вектор CENP-A, описанный выше ⁵⁹ . Один только белок HaloTag также экспрессировался в том же векторе, что и контроль. Вектор, экспрессирующий гистон h3B с меткой SNAP, был ранее описан ⁴⁵ .

Визуализация живых клеток и фиксированных клеток млекопитающих с одной молекулой

ES-клетки, экспрессирующие mEos3.CHD4, меченный 2-HaloTag, пассировали за 2 дня перед визуализацией на 35-миллиметровые чашки со стеклянным дном № 1.0 (MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Case) в сыворотке, не содержащей фенолового красного, и в условиях mLIF. Непосредственно перед визуализацией, если необходимо, клетки метили 5 мкМ лиганда HaloTag-JF ₆₄₆ в течение не менее 15 минут с последующими двумя промываниями в PBS и 30-минутной инкубацией при 37 ° C в среде перед визуализацией клеток в свежая сыворотка без фенолового красного и условия LIF, содержащие 5 мМ Trolox. Флуоресцентные изображения in vivo собирали в виде видеороликов из 10 000 кадров при экспозиции 500 мс.Непрерывное фотопреобразование было достигнуто с использованием лазера с длиной волны 405 нм при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см ² .

Для отслеживания белкового комплекса ES-клетки, экспрессирующие SNAP-меченный гистон h3B или mEos3.2-, HaloTag- и SNAP-меченный CENP-A, были созданы путем трансфекции соответствующих экспрессионных векторов. Четыре микролитра Lipofectamine® 2000 (Life tech, cat. 11668027), инкубированных в 100 мкл OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher Scientific, cat. 31985070) в течение 5 минут, добавляли примерно к 2–3 мкг векторы экспрессии, также инкубированные в 100 мкл OPTI-MEM® в течение 5 мин.Затем смесь инкубировали еще в течение 15 мин перед добавлением к ES-клеткам, которые одновременно пассировали на чашки со стеклянным дном 35 мм. Через 2 дня клетки метили с использованием соответствующих лигандов HaloTag, как описано выше для CHD4. Лиганды меток SNAP также были помечены аналогичным образом, но с начальной инкубацией в течение 30 минут до промывки.

FRET был оптимизирован за счет обеспечения избытка акцепторного красителя вокруг донора mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉ . Для FRET между mEos3.2-tagged CENP-A и JF ₆₄₆ -tagged CENP-A, это осуществляли путем трансфекции 0,4 мкг CENP-A с меткой mEos3.2 или CENP-A с меткой SNAP вместе с 2 мкг CENP-A с меткой HaloTag. А. Для FRET между PA-JF ₅₄₉ с меткой и JF ₆₄₆ с меткой CENP-A или PA-JF ₅₄₉ с меткой h3B и JF ₆₄₆ с меткой h3B это было достигнуто путем мечения клеток после трансфекции с 0,2 µM SNAP-tag PA-JF ₅₄₉ лиганд и 2 µM SNAP-tag JF ₆₄₆ лиганд. Наконец, для CENP-A / h3B FRET — 1 мкг mEos3.2-меченый CENP-A трансфицировали вместе с 1 мкг SNAP-меченного CENP-A и метили 5 мкМ SNAP-tag JF ₆₄₆ лигандом. Клетки, экспрессирующие конструкцию mEos3.2-CENPA, PA-JF ₅₄₉ -CENP-A или PA-JF ₅₄₉ -h3B, были идентифицированы по их способности фотоактивировать отдельные молекулы с использованием лазера 405 нм и клеток, меченных лиганды HaloTag-JF ₆₄₆ или SNAP tag JF ₆₄₆ по их локализации в центромерных фокусах или в ядре (для HaloTag-CENP-A или h3B с меткой SNAP, соответственно), как определено с помощью визуализации с использованием лазера с длиной волны 641 нм. (1 кВт / см ² ).Флуоресцентные изображения фиксированных и живых клеток собирали в виде видеофильмов размером от 3000 до 5000 кадров при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование достигалось с использованием 100 мс экспозиции лазера 405 нм каждые 6 с при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см ² . Для фиксации клеток клетки промывали PBS, фиксировали при комнатной температуре в PBS, содержащем 4% формальдегид, в течение 15 минут, снова промывали в PBS и затем ресуспендировали в PBS, содержащем 5 мМ Trolox.

Обработка и анализ изображений клеток млекопитающих

Фильмы с живыми клетками и фиксированными клетками одиночных молекул были проанализированы с помощью программного обеспечения Rapidstorm, которое определяет локализации одиночных молекул из фильмов PALM ⁶⁸ , после использования коррекции фона катящегося шара изображения с радиусом 5 пикселей.Были проанализированы только флуоресцентные точки шириной менее 5 или 3 пикселей (для микроскопов 1 и 2 соответственно) и с фиксированным глобальным порогом выше 25000. Чтобы отслеживать отдельные молекулы CHD4, CENP-A или h3B, мы использовали специальный код для соединения локализаций отдельных молекул и извлечения длины их траекторий (сценарий можно найти на https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis) . Флуоресцентные точки считались одной и той же молекулой, если они находились в пределах 100 нм между кадрами, потому что мы не ожидаем увидеть более высокие коэффициенты диффузии для связанного h3B / CENP-A / CHD4.Молекулы все еще были связаны, если они не были обнаружены в течение 1 кадра, чтобы уменьшить вероятность того, что молекулы на короткое время упадут ниже порога отношения сигнал-шум. Траектории меньше трех локализаций отбрасываются, чтобы снизить вероятность обнаружения шума. Средняя интенсивность этих траекторий также была извлечена для расчетов эффективности FRET — мы игнорируем первый и последний кадры, потому что молекула могла не флуоресцировать на всех этих кадрах. Изображения одиночных молекул, представленные на рис.4 были сгенерированы с использованием Peak Fit, так что локализации представляют точность, с которой они были локализованы ⁶⁹ . Точность локализации была рассчитана после анализа Rapidstorm путем подбора гистограммы парных расстояний до ближайших соседей ⁷⁰ .

Для отслеживания живых клеток односвязанных молекул CHD4 эксперимент был воспроизведен дважды на Микроскопе 1 и один раз на Микроскопе 2. Мы снова решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить систематические ошибки, возникающие из-за незначительно отличающихся друг от друга микроскопов. выравнивания.Мы собрали 772 и 539 траекторий одиночных молекул из фильмов одиночных молекул для молекул CHD4 с меткой mEos3.2 и mEos3.2 – JF ₆₄₆ , соответственно (обычно в каждом фильме изучались две клетки). Учитывая, что 10–30% отдельных молекул mEos3.2 – JF ₆₄₆ находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения.

Для анализа близости белка FRET CENP-A было собрано больше траекторий, потому что mEos3 относительно мало.Предполагалось, что молекулы с двумя метками будут находиться рядом с молекулами с меткой JF ₆₄₆ . Эксперимент был воспроизведен один раз на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных из Микроскопа 2, в котором мы собрали 17 953, 17 288 и 21 018 траекторий из одномолекулярных фильмов mEos3.2-CENP-A, mEos3. .2-CENP-A / JF ₆₄₆ -CENPA и mEos3.2-CENP-A / JF ₆₄₆ -h3B, соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре клетки). Учитывая, что ~ 0,1–1% mEos3.2 молекулы в присутствии молекул с меткой JF ₆₄₆ находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер образца для демонстрации наблюдаемых нами изменений.

Для анализа близости h3B FRET эксперимент был воспроизведен дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных, в которых мы собрали 2114 и 3970 траекторий из одномолекулярных фильмов PA-JF ₅₄₉ -h3B и PA-JF. ₅₄₉ -h3b / JF ₆₄₆ -h3B соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре клетки).Учитывая, что 10% молекул PA-JF ₅₄₉ в присутствии молекул с меткой JF ₆₄₆ находились во включенном состоянии более 1% от одиночных молекул PA-JF ₅₄₉ , это подходящий размер образца. чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Траектории длиннее 1% одиночных молекул PA-JF ₅₄₉ были идентифицированы и окрашены в синий цвет. Эффективность FRET рассчитывалась с использованием средней интенсивности молекул, меченных одним PA-JF ₅₄₉ . Карты плотности шириной 2 пикселя (312 нм) были созданы, чтобы показать количество молекул, обнаруженных в пределах области, и была ли средняя длина трека ниже (желтый) или выше 12 с (синий), доверительный интервал 1% установлен таким образом, что существует 1% -ная вероятность того, что молекулы, помеченные PA-JF ₅₄₉ , будут иметь длину трека более 12 с.

Доступность данных

Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у авторов по запросу.

Доступность кода

Программное обеспечение, используемое для фотофизического анализа in vitro и отслеживания живых клеток, можно найти на https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis и https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis , соответственно. Другое используемое программное обеспечение включает микро-менеджер программного обеспечения с открытым исходным кодом (https://www.micro-manager.org), ImageJ64,65, Rapidstorm68 и PeakFit69.

Значение FRET на фото — Что означает FRET на фото? Определение FRET

Значение для FRET — это F & Ouml; Rster Rezonans Enerji Transferi, а другие значения расположены внизу, которые имеют место в терминологии Photo, а FRET имеет одно значение. Все значения, принадлежащие аббревиатуре FRET, используются только в терминологии Photo, другие значения не встречаются. Если вы хотите увидеть другие значения, щелкните ссылку «Значение FRET».Таким образом, вы будете перенаправлены на страницу, где указаны все значения FRET.
Если внизу не указано 1 аббревиатура FRET, выполните поиск еще раз, введя такие структуры вопросов, как «что означает FRET на фото, значение FRET на фото». Кроме того, вы можете выполнить поиск, набрав FRET в поле поиска, которое находится на нашем веб-сайте.

Значение астрологических запросов

FRET Значение на фото

1. FÖRster Rezonans Enerji TransferiPhoto

Также вы можете найти значение FRET для фото в других источниках.

Что означает FRET для фото?

Мы составили запросы в поисковых системах о аббревиатуре FRET и разместили их на нашем веб-сайте, выбрав наиболее часто задаваемые вопросы. Мы думаем, что вы задали аналогичный вопрос поисковой системе, чтобы найти значение аббревиатуры FRET, и мы уверены, что следующий список привлечет ваше внимание.

1. Что означает FRET для фото?

   FRET означает FÖRster Rezonans Enerji Transferi.

2. Что означает аббревиатура FRET на фото?

   Сокращение FRET на фото означает «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».

3. Что такое определение FRET?

   Определение FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».

4. Что означает FRET на фото?

   FRET означает, что «FÖRster Rezonans Enerji Transferi» для Фото.

5. Что такое аббревиатура FRET?

   Акроним FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».

6. Что такое сокращение от FÖRster Rezonans Enerji Transferi?

   Сокращенное обозначение «FÖRster Rezonans Enerji Transferi» — FRET.

7. Каково определение аббревиатуры FRET на фотографии?

   Определения сокращенного обозначения FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».

8. Какова полная форма аббревиатуры FRET?

   Полная форма сокращения FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».

9. Что означает FRET в фото?

   Полное значение FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».

10. Какое объяснение FRET на фото?

    Пояснение к FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».

Что означает аббревиатура FRET в астрологии?

Мы не оставили места только значениям определений FRET. Да, мы знаем, что ваша основная цель — объяснение аббревиатуры FRET. Однако мы подумали, что вы можете рассмотреть астрологическую информацию аббревиатуры FRET в астрологии. Поэтому астрологическое описание каждого слова доступно внизу.

FRET Аббревиатура в астрологии

• FRET (буква F)

  Вы идеалистичны и романтичны, возносите своего возлюбленного на пьедестал.Вы ищете лучшего друга, которого можете найти. Вы флиртуете, но когда-то преданы своему делу, вы очень лояльны … Вы чувственны, сексуальны и страстны в личной жизни. На публике вы можете быть эффектным, экстравагантным и галантным. Вы рождены романтиком. Драматические сцены — ваше любимое времяпрепровождение в фантазиях. Вы можете быть очень щедрым любовником.

• FRET (буква R)

  Вы серьезный, ориентированный на действия человек. Вам нужен кто-то, кто может идти в ногу с вами, и кто равен вашему интеллекту, чем умнее, тем лучше.Великий ум заводит вас быстрее, чем великое тело. Однако для вас очень важна физическая привлекательность. Вы должны гордиться своим партнером. В личной жизни вы очень сексуальны, но вы не хвастаетесь, вы готовы служить учителем. Секс важен; вы можете быть очень требовательным товарищем по играм.

• FRET (буква E)

  Ваша самая большая потребность — поговорить. Если ваш партнер не умеет слушать, у вас проблемы с общением. Человек должен быть интеллектуально стимулирующим, иначе вы не заинтересованы в сексе.Вам нужен друг для любовника и компаньон для соседа по постели. Вы ненавидите дисгармонию и разлад, но время от времени вы наслаждаетесь хорошими аргументами, которые, кажется, взбудораживают вас. Вы много флиртуете, потому что вызов для вас важнее полового акта, но когда вы отдаете свое сердце, вы проявляете бескомпромиссную лояльность. Когда у вас нет хорошего любовника, с которым можно заснуть, вы заснете с хорошей книгой.

• FRET (буква T)

  Вы очень чувствительны, скрытны и сексуально пассивны; вам нравится партнер, который берет на себя инициативу.Музыка, мягкий свет и романтические мысли заводят вас. Вы фантазируете, но не можете легко влюбиться и разлюбить. В любви вы романтичны, идеалистичны, мягки и чрезвычайно сильны. Вам нравится, когда ваши чувства и чувства стимулируются, возбуждаются и дразнят. Ты отличный флирт. Вы можете привести свои отношения в соответствие с вашей мечтой, зачастую все это происходит в вашей голове.

Не волнуйтесь «Жизнь так далеко»: Харрингтон и Рохо вносят свой вклад в новую книгу

НЕ ПОЛУЧАЕТ ЭТО ФРЕТ, И ОН ПОЛУЧАЕТ ВАС.

BSA представляет вводное эссе и фотографии в первый гигантский сборник, представляющий карьеру гениального чикагского юмориста DONT FRET в области уличного искусства.

Социологи, антропологи и ребята из художественной школы любят говорить, что художник ведет диалог с улицей, со своими сверстниками и с обществом. Чикагский уличный художник по имени Дон Фрет, более фундаментальный и убедительный, чем большинство других, предлагает вам принять участие в вдумчивом аналитическом диалоге с ним и его персонажами.Он тоже надеется на смех.

После двух с половиной лет подготовки к праздникам DONT FRET представляет свою первую полнометражную книгу о Schiffer Books, и ожидание того стоило.

Хайме Рохо из Бруклинского стрит-арта предоставил фотографии для новой книги, а главный редактор BSA имел честь написать введение. Мы приводим отрывок из этого эссе, чтобы проиллюстрировать опыт DONT FRET:

«Дон’т Фрет, американский рабочий-сатирик по стрит-арту, получивший образование на польском Бродвее, — выдающийся юморист по стрит-арту из Чикаго, автор граффити, документалист и проницательный наблюдатель за обычными людьми и их различными культурами, которые теперь сливаются друг с другом.Благодаря новой мускулистой джентрификации даже они полностью вытесняются более обеспеченными поселенцами. Именно здесь Нельсон Олгрен, «бард пустых и внешних» задокументировал изнанку и дикую сторону Чикаго в 1940-х и 50-х годах в таких книгах, как «Неоновая пустыня» и «Человек с золотой рукой». Как и автор, Don’t Fret включает в свои работы характер улицы. В отличие от Алгрена и более подходящего для этого времени, его работа также является Мета — настоящие персонажи на улице представлены здесь в его искусстве на улице.

He не воссоздает город, он его захватывает. Когда дело доходит до окрестностей Wicker Park, Bucktown и Ukrainian Village в Чикаго, Don’t Fret возрождается его воспоминания, когда он рос там ребенком. У него ярко выраженная психологическая и эмоциональная привязанность к этим местам, даже если морозы шесть месяцев в году, и он считает, что все местные спортивные команды — отстой, в том числе, да, Da Bears.

«Мои родители говорили, что я всегда был забавным в детстве и всегда был смутьяном», — говорит он о своем пытливом уме и саркастической речи еще в 3-м классе, когда родители забрали его из школы. государственная школа и поместила его в чартерную школу.«Это была середина 90-х, и чартерные школы были в Чикаго в новинку. Особенность этой школы заключалась в том, что главным благотворителем школы была саудовская нефтяная компания, а большинство учителей школы были бывшими военными. Так что, хотя это и не было военное училище, я определенно чувствовал это », — говорит он. «Я постоянно был в беде и отвечал учителям», что неудивительно.

«Я думаю, что однажды я спросил учителя истории, который был одержим Китаем, не коммунист ли он, или какой-то умный человек.Это очень рано научило меня всегда подвергать сомнению авторитет и свое окружение. Думаю, я нашел юмор и сатиру как способ справиться с темными временами ».« Темные времена », простое точное описание для этой эпохи, начертанное роликом« Не волнуйся »на здании напротив канала в Хакни-Вик, Лондон, а также название его художественного коллектива. Подобно своей работе дома, он изучает обычное употребление и фразы других культур, которые он посещает, чтобы придумать хитроумные повороты слов и передать собственное чувство иронии.

Он признает, что воспоминания о городе в его юности иногда расплывчаты и податливы перед лицом времени и моря джентрификации, которое изменило его окрестности, но он не чувствует давления, чтобы быть абсолютно фактическим, просто точным и правдивым. по его впечатлению. Когда-то четко очерченные этнические анклавы североевропейского, польского и украинского происхождения, введение разделяющей классы автострады и наводнение пуэрториканцев и других латиноамериканцев в 1960-х и 1970-х годах создали водоворот маргинализированных сообществ, которые пытались зарабатывать себе на жизнь. в то время, когда он приехал.«

Это город Дон Фретса, и романтизм, вероятно, его погубит. Сурово выглядящие нормальные люди с разной позой и проблемной модой бродят по серым тротуарам вместе и по отдельности. Уличная жизнь разделяется в непредсказуемом ритме повседневности; автобусы и машины с клубами грязи, выходящими из выхлопных труб, суровый гаишник, выписывающий штраф, стоя у машины, мужчина на крыльце из красного кирпича опрокидывает бутылку пива своими пухлыми мультяшными губами.Наши недостатки и нелепые качества подчеркиваются вместе с весельем нашей непримечательности с помощью различных обозначений статуса и культурных деталей, каждое из которых вытесняется нашими странностями.

Работа всегда рядом с едой, еда всегда рядом с пивом, а пиво всегда рядом с Da Bears и The Buff. Да, «Чикаго Бафф»; эта коричневая краска, которая появляется и преследует чикагских граффити-писателей и уличных художников, известна в других городах. У вас всегда будет час рассказов о «Баффе» на любом граффити-барбекю в Чикаго.

«Кто-то однажды сказал, что в жизни есть только две константы: смерть и налоги», — согревает он. «Они явно забыли и о баффе. У меня нет статистики по этому поводу, но если бы я был азартным игроком, я был бы готов поспорить, что город Чикаго тратит больше денег на бафф, чем на общественное искусство, так что это говорит? Было бесчисленное количество раз, когда я выставлял кусок в 2 часа ночи и возвращался, чтобы сфотографировать его в 9 утра, и он уже был окрашен в дерьмо коричневый цвет. Интересно, что они тоже выбрали этот цвет, не так ли? Например, кто получил этот контракт на создание тысяч галлонов дерьмовой краски для распыления по всему городу? »

Два отрывка из эссе «Ты здесь.Не волнуйся «. Стивен П. Харрингтон

Другие статьи, которые могут вам понравиться от BSA:

Не волнуйтесь, еще есть время для осенних фотосессий!

Аххх осень. Время изменилось, листья поворачиваются, утро свежее, и мы сталкиваемся с непрекращающимися спорами о том, как скоро СЛИШКОМ скоро появятся рождественские украшения.Но это время пришло — мы готовы приступить к осенним фотосессиям, особенно если вы собираетесь отдыхать на природе. Но не нужно плакать, Роли, еще осталось несколько свиданий, и я всегда буду делать все возможное, чтобы увидеть каждое улыбающееся лицо, которое смогу увидеть в это прекрасное время года! Ярлык для календаря доступности здесь: http://smp.rocks/23kLYsl — прочтите некоторые советы по планированию.

Планирование осенних фотографий

Даты ограничены в это время года, осталось всего несколько дней (и выходные забронированы), поэтому планируйте время занятий в будние дни.Я знаю, что в будни бывает сложно совладать с работой и учебой, но считаю это замаскированным благословением; выходные в это время года — полное безумие в местных парках и садах. Бывают дни, когда мы буквально можем ждать в очереди, чтобы получить место для работы, и это создает очень стрессовую ситуацию для маленьких (а также для пап и фотографов).

Я предпочитаю занятия по утрам для семейных занятий с малышами, и даже у более крупных детей перед школой появляется больше энергии, чем после долгих занятий математикой и естественными науками.Время начала зависит от вас; мы можем работать раньше, поэтому ваш рабочий день будет пропущен меньше, если позволяет температура. Конечно, время для сна всегда царит! Дни стали короче, поэтому «вечерние» занятия — это на самом деле дневные занятия; с 5:00 по времени заката у вас не так много места для маневра, поэтому планируйте начать полные занятия к 3:00.

В это время года так много мест, которые выглядят великолепно, что вы можете разместить практически любую обстановку.