Лада фото: Официальный сайт LADA

Содержание

дилер LADA в г. Москва

Лидеры российского рынка автострахования совместно с АВТОВАЗом запустили массовые программы доступно

«Ингосстрах», «АльфаСтрахование», «Согласие», «Росгосстрах» и «ВСК» запустили специальные программы «умного» страхования (основанное на данных о фактическом использовании или UBI) для автомобилей LADA, подключенных к телематической платформе LADA Connect. Проект направлен на развитие рынка добровольного страхования автомобилей массового сегмента. Первым участником программы станет самый продаваемый в России автомобиль – LADA Granta.Новые массовые программы UBI сделают страхование существенно доступнее. При покупке автомобилей, оснащенных LADA Connect, единоразовая дополнительная скидка на полис КАСКО составит 10%. Кроме того, владельцы «подключенных» автомобилей смогут получать дополнительную скидку при продлении договора страхования до 30% в зависимости от качества вождения (скоринг вождения выполняется автоматически на основе данных телематики LADA Connect).Оливье Морне, вице-президент по продажам и маркетингу марки LADA: «LADA Connect – это новый уровень сервиса и комфорта для наших клиентов. Интеграция технологий Connected Car на этапе производства выполняет еще и важную социальную функцию, повышая доступность добровольного страхования. «Умное» страхование позволяет заметно снизить стоимость полиса. До этого момента его развитие, особенно в массовом сегменте, осложнялось тем, что затраты на установку оборудования могли себе позволить не все автовладельцы и страховые компании. Мы решили данную проблему на системном уровне».Автомобили Granta, оснащенные LADA Connect, уже доступны к заказу в Москве и Московской области, Санкт-Петербурге, Самарской области, Татарстане и в Пермском крае, а в ближайшие месяцы – по всей официальной дилерской сети.Работа LADA Connect основана на техническом решении компании «Лаборатория умного вождения», часть которого – телематическая платформа со специальной системой страхового скоринга обрабатывает данные о вождении и с согласия автомобилиста передает их страховым компаниям. На основе этих данных формируются индивидуальные предложения.Директор по развитию ООО «Лаборатория Умного Вождения» Тимур Кузеев: «Запуск LADA Granta, оснащенных LADA Connect, – эпохальное событие для страхового рынка России. Мы совместно с АВТОВАЗом и лидерами нашего страхового рынка проделали серьезную работу и создали уникальный для массового сегмента продукт, учитывающий лучшие международные практики и опыт, который в перспективе нескольких лет может вывести нашу страну в мировые лидеры по количеству программ UBI. Это значительно повысит инвестиционную привлекательность нашего рынка для глобального автобизнеса».Индивидуализация страховых тарифов выполняет ряд важных общественно значимых функций. По мнению участников рынка, распространение UBI-программ приведет к заметному повышению безопасности движения, сделает страховые продукты доступными для начинающих водителей, прививая им ответственный подход к использованию автомобиля, снизит уровень страхового мошенничества и обеспечит доступ к КАСКО в массовом сегменте, изменяя отношение к страхованию в обществе.Член правления ПАО «Росгосстрах» Елена Белоусенко: «Запуск UBI-программ для LADA Granta, оборудованных LADA Connect, приведет к повышению устойчивости и стимулирует развитие российского рынка автострахования. Индивидуализация скоринга по характеру вождения, позволяет персонализировать оценку. На практике это означает, что для клиента отпадет необходимость платить за чужие риски, и мы сможем предлагать более доступные тарифы, которые сделают КАСКО привлекательным продуктом в массовом сегменте. Мы рады быть участником такого масштабного проекта и считаем, что именно «умное» страхование – это ключевой фактор формирования массового устойчивого страхового рынка».При пролонгации скидка за аккуратное вождение будет суммироваться со стандартным страховым коэффициентом бонус-малус, что снизит стоимость полиса для аккуратных водителей до 50%. Такое снижение цен, как ожидают страховщики, позволит заметно повысить проникновение добровольного автострахования в нашей стране.Директор по маркетингу АО «РН-Банк» Алла Кибизова: «РН Банк, как оператор программ страхования для брендов Альянса, в который входит бренд LADA, видит своей миссией предоставление максимального уровня сервиса клиентам Альянса. Запуск «умного» страхования, с одной стороны, позволит клиентам LADA получать более выгодные условия по страхованию от крупнейших страховщиков, а c другой – выступит драйвером для дальнейшего развития технологий «умного» страхования на российском рынке. Мы видим запуск такого масштабного проекта примером успешной коллаборации крупнейших игроков автомобильного и страхового рынков с целью создать уникальный продукт с высокой клиентской ценностью».Платформа LADA Connect работает по принципу «черного ящика», собирая данные, которые помогают восстанавливать обстоятельства ДТП. Это упрощает и существенно ускоряет процедуру страхового урегулирования, позволяя для удобства автомобилистов частично автоматизировать бюрократические процедуры и переносить их в онлайн. Кроме того, за счет интеграции этой технологии у автовладельцев появится возможность урегулировать убытки без предоставления справок из компетентных органов по событиям, зафиксированным платформой LADA Connect.Заместитель генерального директора по розничному бизнесу СПАО «Ингосстрах» Алексей Власов: «Мы активно работаем с «умными» программами с 2015 года, но их доля в структуре нашего портфеля пока невелика. Причина в достаточно высоких операционных расходах на само оборудование, его установку и подписку на информационный обмен. При этом выгоды таких программ очевидны для нашей компании как в части сбора скоринговых данных и возможности контроля убытков, так и в части развития продуктового предложения «Ингосстраха». Мы крайне позитивно оцениваем внедрение Connected Car с телематическим функционалом от крупнейшего автопроизводителя в стране».Одним из преимуществ LADA Connect является пересекающаяся интеграция данных, которая создает единую экосистему коммуникации между партнерами и участниками проекта. Например, автовладелец сразу после оформления договора страхования сможет видеть условия страховой программы в мобильном приложении LADA Connect. Там же он сможет отслеживать свой текущий скоринговый балл для скидки на пролонгацию.Руководитель практики Affinity ООО «Страховой Брокер Виллис СНГ» Аррожейро Элдер Жорж Мартинью и Генеральный директор ООО «АСТ» (генеральный партнер Willis Towers Watson по розничному автострахованию в России) Каро Карапетян: «Оформление договоров страхования в дилерских центрах LADA реализуется через централизованную IT-систему выпуска полисов, разработанную партнером RCI Group (АО «РН-Банк» — банк Альянса Renault-Nissan-Mitsubishi) международным брокером Willis Towers Watson (NASDAQ: WLTW), внедренную и обслуживаемую совместно с ООО «АСТ». Это позволяет оптимизировать процесс работы со страховой документацией в одной системе, а также вести единую отчетность со страховщиками. Процесс полностью автоматизирован для дилеров и автопроизводителя, что значительно упрощает процесс работы и управления. Внедрение «умных» программ позволит реализовать дополнительную сервисную поддержку для Клиентов и значительно упростит сопровождение при наступлении страховых случаев».Мировая практика развития «умного» страхования предполагает два пути. Первый – интеграция телематических решений страховыми компаниями, которые продают или дают в аренду «черные ящики» автовладельцам на время действия полиса. Второй – формирование страхового продукта на основе данных, собираемых системой, интегрированной на этапе производства. Второй подход привел к бурному росту «умного» страхования в ЕС, США и Китае в последние годы. В России в силу низкого проникновения добровольного автострахования и исторических особенностей рынка первый путь оказался неэффективен. На этом фоне интеграция телематических систем такими крупными производителями, как АВТОВАЗ, будет стимулировать рынок и повлечет за собой существенный рост проникновения не только «умного» КАСКО, но и добровольного автострахования в целом.Заместитель генерального директора по развитию бизнеса ВСК Ольга Сорокина: «Мы рады старту нового проекта с АВТОВАЗом. Недавно мы обновили программу «Умное КАСКО» для удобства потребителей, оптимизировав внутренние процессы компании с интеграцией оператора телематики. Запуск серийного производства автомобилей LADA с телематической платформой Connected Car позволит реализовать специальные страховые программы и предложить новые возможности для наших клиентов. Благодаря проекту аккуратным водителям будут доступны более персонифицированные условия страхования по КАСКО, дополнительная скидка на страховку автомобиля».По данным ЦБ в 2020 году проникновение КАСКО к ОСАГО в России составило 9,6%. Это очень скромный по мировым меркам результат. Для сравнения, в ЕС этот показатель достигает 78%. Распространение «умного» страхования в массовом сегменте рынка позволит увеличить его, не повышая убытки страховых компаний, что в перспективе может привести к еще большей доступности добровольного страхования.Директор департамента андеррайтинга автострахования АО «АльфаСтрахование» Илья Григорьев: «Наша компания стратегически нацелена на развитие современных программ и технологий, позволяющих улучшать качество клиентского сервиса и портфеля. Благодаря запуску LADA Granta, оснащенных LADA Connect, мы видим большие возможности синергии использования сервисов Connected Car и потенциал для развития современных страховых программ».Лежащая в основе принципа работы «умного» страхования индивидуализация страхового предложения происходит на основе данных о фактическом вождении – сколько и где автомобиль ездит, как часто водитель нарушает правила, превышает скорость или совершает опасные маневры. Сбор этих данных происходит тремя путями: через так называемые «черные ящики» – стационарно установленные в авто подключенные к сети интернет-устройства с акселерометром и GPS/ГЛОНАСС чипом, через мобильные приложения или простые GPS-трекеры. АВТОВАЗ пошел по самому технологичному и перспективному пути, выбрав для своих автомобилей продвинутую «подключенную» систему, которые в мировой практике пока редко применяется при производстве автомобилей массового сегмента.Андрей Ковалев, Директор по розничному андеррайтингу и партнерским продажам страховой компании «Согласие»: «ООО «Согласие» является партнером LADA Страхование с момента запуска программ от автопроизводителя в партнерстве с АО «РН-Банк». Мы следили за ходом реализации проекта и ждали запуск LADA Granta, оснащенных LADA Connect. Функционал автомобиля и телематической платформы позволяет нам вести контроль статистики и убытков в режиме онлайн. В наших планах наращивать продажи специальных программ для «подключенных автомобилей» — это позволит вывести управление продуктами на новый современный уровень и предложить для наших клиентов новые сервисные возможности».LADA Connect позволяет владельцу удаленно управлять функциями автомобиля при помощи смартфона, а также получать статистическую информацию об использовании автомобиля, которая помогает контролировать эксплуатационные расходы и вести удаленную коммуникацию с дилерскими центрами LADA и Автопроизводителем.Генеральный директор «Лаборатории Умного Вождения» Михаил Анохин: «Создание современной цифровой экосистемы вокруг автомобилей LADA открывает новые возможности для автовладельцев и связанных с автомобилями бизнесов. Запуск программ доступного UBI-страхования стало одним из первых подобных решений. Надеюсь, что наши совместные разработки послужат надежным связующим звеном между страховыми компаниями и автомобилистами и это позволит покупателям LADA получить самый доступный и удобный страховой продукт на рынке».***Контакты PR-Служб:АО «АВТОВАЗ» — (8482) 75-77-15, +7 (499) 263-08-50, e-mail: [email protected]ПАО «СК «РОСГОССТРАХ» — Бирюков Андрей Аскольдович (Andrey Biryukov), Руководитель блока PR ПАО «СК «РОСГОССТРАХ», Моб.: +7-910-404-94-56, e-mail: [email protected]СПАО «Ингосстрах» — Людмила Мегаворян, Пресс-секретарь, Моб.: +7 915 402 02 10, [email protected]САО «ВСК» — Ларин Павел, Руководитель направления по связям с общественностьюДепартамент маркетинговых коммуникаций и PR, Блок развития бизнеса, Тел.: +7 (495) 7274444, доб. 2962, Моб.: +7 926 503-17-00, [email protected]ООО «СК «Согласие» — Елена Григорьева, Моб.: +7 903 599 35 59, Олеся Карпова, Моб.: +7 926 911 00 38, e-mail: [email protected]АО «АльфаСтрахование» — Карцева Мария, Руководитель PR-Службы АО «АльфаСтрахование», Моб.: +7 962 923-74-49, e-mail: [email protected]АО «РН-Банк» — Алла Кибизова, Директор по маркетингу, тел.: +7 985 456 00 30, e-mail: [email protected] Towers Watson — Аррожейро Элдер, +7-495-258-55-54, e-mail: [email protected]ООО «АСТ» — Наталья Дегтярева, Директор по маркетингу и развитию, Моб.: +7-903- 100-45-72, e-mail: [email protected]ООО «Лаборатория Умного Вождения» — Александр Корольков, +7-915-497-65-75, e-mail: [email protected]***Группа »АВТОВАЗ» является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Groupe Renault. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для 2-х брендов: LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО »АВТОВАЗ”, ОАО “LADA Запад Тольятти”, а также в Ижевске – ООО »LADA Ижевск». Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в более чем 20 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.ПАО СК «Росгосстрах» — флагман отечественного рынка страхования. На территории Российской Федерации действуют около 1 500 офисов и представительств компании, порядка 300 центров и пунктов урегулирования убытков. В компании работает около 50 тысяч сотрудников и страховых агентов. «Росгосстрах» входит в Группу «Открытие» — один из крупнейших финансовых холдингов нашей страны, и является стратегическим провайдером страховых продуктов и услуг в компаниях группы «Открытие».СПАО «Ингосстрах» — работает на международном и внутреннем рынках с 1947 года, занимает лидирующие позиции среди российских страховых компаний.«Ингосстрах» имеет право осуществлять все виды имущественного страхования, добровольное медицинское страхование и страхование от несчастных случаев и болезней, установленные ст.32.9 Закона РФ «Об организации страхового дела в Российской Федерации», а также перестраховочную деятельность. Компания присутствует в 251 населенном пункте РФ. Представительства и дочерние компании страховщика работают в странах дальнего и ближнего зарубежья.Страховой Дом ВСК (САО «ВСК») работает с 1992 года и является универсальной страховой компанией, предоставляющей услуги физическим и юридическим лицам на всей территории России. Компания стабильно входит в ТОП-10 страховщиков страны по сборам в основных сегментах страхового рынка – автостраховании, страховании от несчастных случаев и болезней (НС) и добровольном медицинском страховании (ДМС). На сегодняшний день более 30 млн человек и 500 тысяч организаций воспользовались продуктами и услугами ВСК. Региональная сеть компании насчитывает свыше 500 офисов во всех субъектах России, что дает возможность эффективно сопровождать договоры страхования по всей стране.ООО «СК «Согласие» входит в единую страховую группу с ООО «Согласие-Вита» и успешно ведет свою деятельность на страховом рынке уже более 27 лет. Внутренняя политика Компании позволяет нам уверенно удерживать высокие позиции на страховом рынке и ежегодно увеличивать число страхователей.Группа «АльфаСтрахование» – крупнейшая частная российская страховая группа с универсальным портфелем страховых услуг, который включает как комплексные программы защиты интересов бизнеса, так и широкий спектр страховых продуктов для частных лиц. Услугами «АльфаСтрахование» пользуются более 31 млн человек и свыше 106 тыс. предприятий. Региональная сеть насчитывает 270 филиалов и отделений по всей стране. Надежность и финансовую устойчивость компании подтверждают рейтинги ведущих международных и российских рейтинговых агентств: «ВВ+» по шкале Fitch Ratings, «ВВB-» по шкале S&P и «ruАAA» по шкале «Эксперт РА» и «ААА ru» по шкале «Национального рейтингового агентства».«РН-БАНК» – «Банк Альянса Renault-Nissan-Mitsubishi». Почти вековая история Банковской Группы Рено берет свое начало в 1924 году во Франции. Сейчас Группа представлена в 36 странах мира, а на российском рынке оказывает поддержку клиентам, выбирающим продукцию брендов Альянса, с 2006 года. Приоритетными направлениями деятельности Банка являются: кредитование физических лиц на приобретение автомобилей брендов Альянса, финансирование дилеров брендов Альянса, а также оказание клиентам сопутствующих финансовых услуг. По состоянию на конец 2019 года Банк занимает 58 место по размеру активов среди российских банков по версии Интерфакс, показав прирост в 19% и поднявшись на 4 позиции за 12 месяцев.Willis Towers Watson — ведущая международная консалтинговая и брокерская компания, разрабатывающая современные бизнес-решения, которые помогают нашим клиентам по всему миру преобразовывать риски в возможности развития и роста. Наша компания была основана в 1828 г., и в настоящее время насчитывает 45 000 сотрудников, предоставляющих услуги для более чем 140 стран и рынков.«Страховые брокеры «АСТ» — являются одним из ведущих страховых брокеров, оказывающих полный спектр страховых брокерских услуг и услуг в области риск консалтинга с 2007 года. ООО «Страховые брокеры «АСТ» оказывают страховые брокерские услуги по всем видам страхования, а также не противоречащие законодательству Российской Федерации сопутствующие консультационные услуги в области управления рисками.«Лаборатория умного вождения» – российский разработчик универсальной автомобильной телематической платформы и системы LADA Connect. Созданные в «Лаборатории умного вождения» аппаратно-программные решения превращают автомобиль в подключённое к сети Интернет устройство. Специалисты «Лаборатории умного вождения» оказывают адаптированный под каждого клиента набор услуг – от круглосуточного мониторинга состояния автомобиля и защиты от угона до анализа эксплуатационных параметров, контроля расходов и оценки безопасности вождения. Страховым компаниям решения «Лаборатории умного вождения» помогают провести селекцию страхового портфеля и сформировать индивидуальные страховые тарифы для клиентов. Автопроизводителям и автопаркам – внедрить инновационные подходы в бизнесе.

фото и новые подробности :: Autonews

Автомобили Lada Vesta FL проходят дорожные испытания, которые попали на фото. Снимки опубликовал портал «Лада.Онлайн».

Сами испытания начались еще зимой в Тольятти. Тогда фотошпионы заметили автомобили, у которых передняя и задняя части были покрыты камуфляжем. Впрочем, было понятно, что это Vesta FL.

Теперь появились новые фотографии, которые еще больше раскрывают образ будущей новинки.

Фотошпионы засняли испытания Lada Vesta FL 2022 (Фото: VK / AvtoVAZ news)

Фотошпионы засняли испытания Lada Vesta FL 2022 (Фото: VK / AvtoVAZ news)

Сообщается, что машины в рамках испытаний с середины зимы наездили уже более 3 тысяч км.

В мае фотошпионы засняли салон Vesta FL. На снимках видно, что водителю будет доступен вертикальный экран-планшет мультимедийной системы. Ожидается, что такой дисплей будет у всех версий рестайлинговой Vesta.

Помимо этого, в машине будет многофункциональный четырехспицевый руль, модернизированная приборная панель, система бесключевого доступа в салон и функция контроля слепых зон.

Как писал Autonews.ru, Lada Vesta FL в базовом исполнении будет отличаться от «старших» вариантов радиаторной решеткой с вертикальными планками вместо узора в виде крупных сот, комбинированной головной оптикой и колеcными дисками.

LADA Granta Cross – Обзор модели, фото – Первый Лада Центр, Краснодар.

1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Classic (21941-A1-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Comfort (21941-A1-X31)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Comfort (21947-A1-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Comfort (21947-A1-XR0)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Luxe (21947-A2-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Luxe (21947-A2-XR0)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

ОТЕЛЬ ЛАДА-РЕЗОРТ 4* (Тольятти) — отзывы, фото и сравнение цен

Часто задаваемые вопросы об отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ

Какие популярные достопримечательности находятся недалеко от отеля Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Ближайшие достопримечательности: Памятник В. Н. Татищеву (2,0 км), Спасо-Преображенский собор (7,2 км) и Тольяттинский краеведческий музей (7,4 км).

Какие удобства и услуги доступны в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Самые популярные предлагаемые удобства и услуги: крытый бассейн, бесплатный Wi-Fi и бесплатный завтрак.

Какие удобства и услуги в номерах доступны в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Лучшие удобства и услуги в номерах: мини-бар, кондиционер и ТВ с плоским экраном.

Какая еда и напитки доступны в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Во время пребывания у гостей есть возможность воспользоваться следующими услугами питания: бесплатный завтрак и ресторан.

Доступна ли парковка в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Да, гостям предоставляется доступ к услугам парковки бесплатная парковка, охраняемая парковка и парковка на улице.

Какие рестораны расположены недалеко от отеля Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Поблизости находятся следующие рестораны: 20 Франков, Union Bar и Ведро гвоздей.

Есть ли в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ возможность заниматься спортом?

Да, во время пребывания гостям предоставляется доступ к следующим фитнес-услугам: крытый бассейн, фитнес-центр и сауна.

Предлагает ли отель Отель ЛАДА-РЕЗОРТ трансфер от/до аэропорта?

Да, отель Отель ЛАДА-РЕЗОРТ предлагает гостям трансфер от/до аэропорта. Мы рекомендуем позвонить заранее и уточнить все подробности.

Предоставляются ли в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ услуги уборки?

Да, гостям предоставляется доступ к услугам уборки химчистка и прачечная.

Предлагает ли отель Отель ЛАДА-РЕЗОРТ какие-либо бизнес-услуги?

Да, в отеле предлагаются бизнес-услуги бизнес-центр, конференц-залы и банкетный зал.

На каких языках говорит персонал отеля Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Персонал говорит на нескольких языках, включая английский, французский, немецкий и русский.

Нужна дополнительная информации?

В Сети появились первые «живые» фото нового седана Lada Granta

В преддверии Московского международного автосалона концерн «АвтоВАЗ» в сюжете своего корпоративного телеканала «засветил» фотографии экстерьера обновленного автомобиля Lada Granta FL Sedan, пишет «Российская газета».

Этот седан станет первой моделью в новом семействе Granta, в который также будут входить лифтбек, хэтчбек, универсал и кросс-универсал. Как говорится в сюжете телеканала, у новой Granta полностью переработана передняя часть кузова, а «икс-графика» (характерные крестообразные выштамповки на бортах современных моделей тольяттинской марки, напоминающие букву Х латинского алфавита) выделена хромированными вставками в форме бумерангов, что «подчеркивает принадлежность авто к Lada нового поколения».

«Думаю, вы согласны с тем, что новый автомобиль выглядит намного лучше в сравнении с существующей Granta. Эти изменения помогут ему удержать конкурентные преимущества», – сказал главный дизайнер Lada Стив Маттин во время презентации машины.

Напомним, 17 июля российский автогигант распространил первые официальные рендеры экстерьера нового седана Granta, судя по которым обновленная версия отличается полностью измененным оформлением передней части: у нее другие фары, бампер, решетка радиатора, капот и передние крылья. Также спереди есть X-образное оформление, напоминающее модели нового поколения Lada: Vesta и Xray.

Частично изменилась и задняя часть автомобиля. Здесь появилась новая крышка багажника с нишей под номерной знак, перекочевавшей с бампера, и сам бампер с измененным дизайном. Интерьер новинки «АвтоВАЗ» пока не раскрыл, а по технической части перемен в автомобиле не запланировано.

Премьера обновленной Lada Granta состоится на Московском международном автосалоне, который пройдет с 29 августа по 9 сентября. Одновременно планируется начать выпуск машины.

Житель Краснодарского края погиб в ДТП с грузовиком в Адыгее

Фото: МВД по Адыгее

Фото: МВД по Адыгее

ДТП произошло 9 августа в 07.50 на автодороге Краснодар – Верхнебаканский в Тахтамукайском районе.

Установлено, что во время движения водитель ВАЗ-2109 проявил невнимательность и столкнулся с находившимся на полосе грузовым автомобилем дорожных служб. В результате 21-летний водитель отечественного авто скончался от полученных травм. Его 19-летний пассажир доставлен в больницу. Оба – жители Краснодарского края.

Уточняется, что перед местом проведения работ были установлены соответствующие информационные знаки.

По факту происшествия ГИБДД Тахтамукайского района проводится проверка. Устанавливаются причины аварии, сообщает пресс-служба МВД по Адыгее.

Еще одно смертельное ДТП произошло 26 июля в Кошехабльском районе Адыгеи. 62-летний местный житель, двигаясь по дороге Майкоп – Гиагинская – Псебай на автомобиле «Лада», съехал с проезжей части. После этого машина опрокинулась. В результате происшествия водитель скончался на месте происшествия.

В ночь на 23 июня в Адыгее произошла авария, в которой погиб один человек и четверо получили травмы. 23-летний житель города Лабинска, управляя автомобилем «Лада Гранта», не справился с управлением. Машина вылетела с дороги, врезалась в дорожное ограждение и перевернулась. Водитель от полученных травм скончался. Четверо пассажиров легковушки были госпитализированы в Адыгейскую республиканскую клиническую больницу.

Россиянам запретили употреблять сладкое в пандемию

Специалисты считают, что во время пандемии коронавируса необходимо сократить потребление сладостей.

Об этом шла речь сегодня на пресс-коференции в Доме журналистов по поводу того, как восстановиться после коронавируса. У опасной инфекции есть такая особенность, как массивность поражения — практически все органы и системы попадают под удар.

— За это время мы все привыкли к тому, что страдают лёгкие. Да, это так. И даже если человек не чувствует симптомов, обычно небольшие проценты, небольшие уровни повреждения всё-таки есть, — говорит терапевт, клинический фармаколог, врач превентивной и интегральной медицины, ассистент кафедры фармакологии ОмГМУ Лада Ступакова. — Я бы ещё отметила нервную систему. Сейчас есть много исследований по повреждению головного мозга, нервной системы как самим вирусом, так и за счёт ответа организма. Ну и, конечно, повреждения могут быть и кишечника, и печени. После коронавируса могут происходить активации иммунного характера, то есть возникает вдруг сахарный диабет или повреждение печени, то есть сам организм и вирус повреждает все системы.

Даже если вы перенесли коронавирус в лёгкой форме, за здоровьем после заболевания нужно следить внимательнее. Инфекция может себя ещё проявить.

Лада Ступакова

Лада Ступакова рекомендовала уменьшить употребление сладкого, а в случае заражения коронавирусом вообще отказаться от него. Лучше налегать на белковую пищу.

— Не надо есть кондитерские изделия, выпечку, сладости, когда идёт вот эта волна, весь период. Лучше уменьшать. А когда заболели, прямо убирать всё, что имеет сладкий вкус и то, что всем хочется, — рассказала Лада Ступакова. — До, во время и после коронавируса очень важен белок. Иммунная система зависит от многих факторов, но если говорить о питании, то это белки, так как часть иммунного ответа строится на белках.

Ранее «Омск Здесь» сообщал, что преодолеть пандемию и снять ограничения в Омской области, по словам главы региона, поможет только массовая вакцинация. Обязательная вакцинация омичей более 50 категорий занятости была введена постановлением омского управления Роспотребнадзора от 4 июля 2021 года. Ранее мы публиковали топ-8 вопросов о вакцинации.

Фото: Дом журналистов

Amazon.com: Персонализированный фотоальбом — нейтральный фон с розовыми буквами лада: Handmade



Настраиваемый

Настроить сейчас Настроить сейчас

Что-то пошло не так.Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Что-то пошло не так. Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Покажите свои драгоценные фотографии в этом красивом персонализированном фотоальбоме. Общие размеры этого фотоальбома: 13 1/2 дюймов Д x 8 1/2 дюймов Ш x 2 1/4 дюйма В. Каждый альбом вмещает 204 фотографии размером 4 x 6 дюймов. дополнительные страницы пополнения (продаются отдельно).Прозрачные карманы предназначены для боковой загрузки и фотобезопасности: без выбросов кислоты и полипропилена. ** Дополнительные элементы на фото в продажу не входят. Это объявление только для одного фотоальбома.

h3.default { цвет: # CC6600; размер шрифта: средний; маржа: 0 0 0,25em; } #productDescription_feature_div> h3.books { цвет: # 333! важно; размер шрифта: 21px! важно; высота строки: 1,3; padding-bottom: 4px; шрифт: нормальный; маржа: 0px; } #productDescription_feature_div> h3.softlines { цвет: # 333! важно; размер шрифта: 21px! важно; высота строки: 1.3; padding-bottom: 4px; font-weight: жирный; маржа: 0px; } #productDescription> p, #productDescription> div, #productDescription> table { маржа: 0 0 1em 0; } #productDescription p { маржа: 0em 0 1em 1em; } #productDescription h4 { шрифт: нормальный; цвет: # 333333; размер шрифта: 1.23em; ясно: слева; маржа: 0.75em 0px 0.375em -15px; } #productDescription table { граница-коллапс: наследование! важно; нижнее поле: 0; } #productDescription table img { максимальная ширина: наследовать! важно; } #productDescription table td { размер шрифта: маленький; вертикальное выравнивание: наследование! важно; } #productDescription ul li { маржа: 0 0 0 20 пикселей; } #productDescription ul li ul { тип-стиль списка: disc! important; маржа слева: 20 пикселей! важно; } #productDescription ul ul li { тип-стиль списка: disc! important; маржа слева: 20 пикселей! важно; } #productDescription> ul ul li { тип-стиль списка: disc! important; } #productDescription ul li ul li { маржа: 0 0 0 20 пикселей; } #Описание товара .aplus p { маржа: 0 0 1em 0; } #productDescription small { размер шрифта: меньше; } # productDescription.prodDescWidth { максимальная ширина: 1000 пикселей } ]]>

Разработка флуоресцентных датчиков на основе комбинации ПЭТ (фотоиндуцированный перенос электронов) и FRET (резонансный перенос энергии Фёрстера) для обнаружения воды

Флуоресцентные датчики DJ-1 и DJ-2 с большим стоксовым сдвигом (SS) на основе комбинации PET (фотоиндуцированный перенос электронов) и FRET (резонансный перенос энергии Фёрстера) были разработаны для обнаружения вода в органических растворителях. DJ-1 состоит из эфира антрацен- (аминометил) фенилбороновой кислоты в качестве донорного флуорофора типа ПЭТ и скелета BODIPY в качестве акцепторного флуорофора в процессе FRET. Напротив, DJ-2 состоит из антраценового скелета в качестве донорного флуорофора и скелета сложного эфира BODIPY- (аминометил) фенилбороновой кислоты в качестве акцепторного флуорофора ПЭТ-типа в процессе FRET. Фактически, добавление воды к органическим растворителям, содержащим DJ-1 или DJ-2 , вызывало как подавление ПЭТ, так и передачу энергии от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору через процесс FRET, что приводило к усилению флуоресценции. группа, происходящая из скелета BODIPY.Кроме того, значения псевдо-SS DJ-1 и DJ-2 между максимумом фотопоглощения антраценового флуорофора и максимумом флуоресценции флуорофора BODIPY составляют 7563 см -1 (141 нм) и 8017 см -1 (153 нм), соответственно, что значительно выше, чем у типичного флуоресцентного датчика на основе ПЭТ. Было установлено, что эффективность FRET для DJ-1 является количественной, но для DJ-2 была оценена примерно в ок. 50% на основе измерений времени жизни флуоресценции с временным разрешением. Более того, предел обнаружения DJ-1 для воды превосходит предел обнаружения DJ-2 . Основываясь на механизме определения флуоресценции DJ-1 и DJ-2 для воды, мы предполагаем, что комбинация донорного флуорофора ПЭТ-типа и акцепторного флуорофора в процессе FRET является одной из наиболее многообещающих молекулярных конструкций для создать эффективный флуоресцентный датчик для обнаружения воды в органических растворителях.

Эта статья в открытом доступе

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Интернет-кампус ZEISS Microscopy | FRET-микроскопия со спектральной визуализацией

Введение

Сложная ассоциация между белками и путями передачи сигналов, которые контролируют клеточную функцию, зависит от множества слабых и временных динамических взаимодействий, которые часто трудно или даже невозможно охарактеризовать с помощью традиционной биохимической методологии.Флуоресцентная микроскопия продемонстрировала превосходную чувствительность при обнаружении чрезвычайно низких концентраций меченых биомолекул в очень широких пространственных и временных измерениях. С появлением и разработкой высокоэффективных генетически кодируемых флуоресцентных белков, которые могут стабильно экспрессироваться в живых клетках, несколько методов флуоресценции стали мощными инструментами для визуализации динамических взаимодействий между белками in situ и в физиологических условиях. В частности, применение резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) становится все более популярным, чтобы служить в качестве молекулярной линейки при определении межмолекулярных расстояний или для демонстрации того, образуются ли даже молекулярные комплексы.Для конструирования биомолекул, потенциально способных к взаимодействию FRET, можно использовать простые методы молекулярной биологии для слияния кДНК, кодирующей флуоресцентные белки, с белками-мишенями, которые, как предполагается, участвуют. В настоящее время предпочтительными флуоресцентными белками для анализа FRET являются Aequorea victoria, производные GFP медузы с голубой и желтой эмиссией (ECFP и EYFP) в качестве доноров и рецепторов соответственно. Хотя ECFP и EYFP использовались в многочисленных исследованиях FRET, несколько новых и более совершенных вариантов, Cerulean (производное голубого) и Citrine или Venus (желтые производные), оказались очень эффективными в обеспечении расширенного динамического диапазона, необходимого для внимательно следите за чувствительными сигналами FRET.Кроме того, продолжающееся расширение цветовой палитры флуоресцентных белков предоставляет новых кандидатов в оранжевой, красной и дальней красной области спектра в качестве потенциальных партнеров FRET для существующих голубых, зеленых и желтых белков.

Одним из наиболее полезных приложений FRET в клеточной биологии является метод, который включает слияние двух флуоресцентных белков с концами экологически чувствительного белка или пептида, чтобы действовать как биосенсор определенных клеточных функций.Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение в сообщении о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков, способных к FRET, с биополимерами, которые выполняют важные функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как кальциевая волна. индукция, эффекты передачи циклических нуклеотидов, pH, флуктуации мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточных протеаз.Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. Рисунок 1). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков (в данном случае Cerulean и Venus), связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, датчик демонстрирует очень сильный резонансный перенос энергии, который полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности. Поскольку метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами.Принципы резонансной передачи энергии Ферстера (FRET)

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении света флуорофором на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Максимумы (пики) спектральных профилей возбуждения и излучения отделены друг от друга переменной шириной полосы в диапазоне от десятков до сотен нанометров. Маркировка внутриклеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. Используя этот метод, молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, оказываются совпадающими (и говорят, что они колокализуются). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что возможна молекулярная ассоциация.В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. FRET — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии (донор , ) ко второму флуорофору (акцептор , ) в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения FRET могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий.

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который способен передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом посредством дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения флуорофора в возбужденном состоянии как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии (которая не происходит в FRET) требует испускания и последующего повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. . В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансного переноса энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции (от которой экспериментальная эффективность FRET можно извлечь).Если акцептор является флуоресцентным, он будет излучать фотоны в соответствии со своим характерным спектральным профилем, производя, таким образом, измеримое ратиометрическое изменение сигнала. Большое отношение интенсивности акцептора к донору указывает на высокую эффективность FRET, которая также может быть приписана более короткому расстоянию или более благоприятной ориентации между флуорофорами. Эффективность процесса передачи энергии ( E FRET ) изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора ( r ), как показано в уравнении, представленном ниже.Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорофором, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга. Таким образом, эффективность FRET математически можно описать как:

E FRET = 1 / [1 + (r / R 0 ) 6 ]

, где R 0 (обычно называемый радиусом Ферстера) представляет собой характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов.В дополнение к требованию близости, эффективная передача энергии требует значительного перекрытия спектров излучения донора и спектров поглощения акцептора (как показано на рисунке 2). Эффективность повышается за счет увеличения квантового выхода донора и / или коэффициента экстинкции акцептора. Например, квантовый выход ECFP составляет 0,40, тогда как квантовый выход Cerulean примерно на 50 процентов больше, что увеличивает эффективность FRET, когда Cerulean заменяется на ECFP в качестве донора FRET.Точно так же коэффициент экстинкции Венеры примерно на 11 процентов выше, чем у EYFP, что делает Венеру лучшим акцептором FRET. В общем, спектральное перекрытие между донором и акцептором должно быть достаточным для обеспечения радиуса Ферстера, который составляет приблизительно 4 нанометра или более. Другим важным параметром, который следует учитывать при выборе флуоресцентных белков в качестве пар FRET, является соответствие относительной скорости созревания. Время, необходимое для созревания хромофора, колеблется от нескольких минут до многих часов, в зависимости от конкретного белка, и может широко варьироваться в пределах других близкородственных вариантов.Измерения FRET будут скомпрометированы в случаях, когда донорский флуоресцентный белок созревает значительно быстрее или медленнее, чем акцептор.

Для оптимизации измерений FRET необходимо учитывать множество других факторов. Одна из основных проблем — относительная яркость донорных и акцепторных флуорофоров. Как правило, из-за ограниченного динамического диапазона большинства микроскопов сопоставимые по яркости флуорофоры дают более удовлетворительные результаты. Значительное несоответствие яркости часто приводит к тому, что сигнал от одного флуорофора насыщает канал детектора, а сигнал от другого (диммера) флуорофора теряется в минимальном уровне шума.Другой часто встречающейся ловушкой является прямое возбуждение акцептора на длине волны, используемой для возбуждения донора, что приводит к избыточной эмиссии акцептора, которая не возникает в результате FRET. Этот артефакт называется спектральным просачиванием акцептора . Кроме того, флуоресцентное излучение от донора может просачиваться в канал обнаружения акцептора (известный как донорский спектральный проход ), что также приводит к искусственно завышенным значениям FRET (рис. 2). В связи с тем, что эти источники проступания будут присутствовать практически во всех парах FRET, они неизбежно должны быть устранены во время измерений FRET.Флуоресцентные белки в анализе FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, которые идеально подходят для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки. Точно так же квантовые точки могут использоваться для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне плазматической мембраны, но эти зонды не могут проникнуть через мембрану и поэтому мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии, комплекс Гольджи. , или эндоплазматический ретикулум.Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время являются одними из лучших кандидатов на флуорофоры для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением. Однако многие из типичных артефактов, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от ширины полосы 30-40 нм при полной ширине на полувысоте ( FWHM ), характерной для спектральных профилей излучения многих синтетических красителей, во флуоресцентных белках они колеблются от примерно 60 до более 100 нм, что часто приводит к значительные области перекрытия при попытке разделить флуоресценцию донора и акцептора.Таким образом, широкие спектральные профили флуоресцентных белков ограничивают количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220-230 аминокислот, свернутый в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (так называемый бета -ствол ; см. Рисунок 3) и состоящий из сильно связанных водородными связями beta -листы, которые окружают и защищают центральную alpha -спираль, содержащую остатки, образующие хромофор.Концы цилиндра закрыты полускиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов, воды и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET (рис. 3). Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентных белков пептидными остатками (на ограничивающем близком расстоянии от 2 до 3 нанометров), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET, которую можно получить с флуоресцентными белками, примерно до 40 процентов от теоретическое значение.Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Проблемы, связанные со спектральной шириной полосы и размером, с которыми сталкиваются флуоресцентные белки, также связаны с их высоким сродством к олигомеризации. Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria и его производных димеризоваться при иммобилизации в высоких концентрациях (например, когда связаны с плазматической мембраной).Этот артефакт также наблюдался в мотиве строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных в рифовых кораллах и морских анемонах. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен на конкретное субклеточное место. После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы.Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природных олигомеров (таких как актин, тубулин и щелевые соединения; см. Рисунок 4). Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание, при условии, что локализованная концентрация остается низкой. Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, как описано выше, локальная концентрация белка может стать достаточно высокой, чтобы позволить димеризацию.Это явление может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые часто дают сложные наборы данных, которые иногда скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков медуз в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Клеточный дистресс, ведущий к апоптозу или некрозу, — это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков.Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое происходит при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров, светодиодов и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп. В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы склонны реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку.Флуоресцентные белки обычно не фототоксичны для клеток, отчасти из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки (см. Рисунок 3). При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах. Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.К сожалению, низкие коэффициенты поглощения и квантовые выходы мономерных оранжевых и красных флуоресцентных белков препятствуют их широкому применению в анализе FRET. Возможно, по мере открытия новых вариантов флуоресцентных белков зонды в более длинноволновых цветных областях станут полезными акцепторами FRET для желтых и зеленых доноров.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET и не мешают другим важным биологическим явлениям.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки рифовых кораллов (обсуждаемые выше) имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось о флуоресцентном белке, способном генерировать активные формы кислорода ( ROS, ) при освещении зеленым светом, как об эффективном агенте для инактивации определенных белков с помощью хромофорной инактивации света ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed, способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности ECFP и EYFP показали, что даже через хромофоры, способные генерировать синглетный кислород, эти зонды неэффективны в качестве фотосенсибилизаторов. Однако продолжительное освещение клеток, экспрессирующих любой вариант EGFP, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным показателем возможности фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной покадровой визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, вращающегося диска, многофотонного и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. газоразрядная лампа против лазерной системы. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Первая пара флуоресцентных белков, разработанная для анализа FRET, представляла собой синий вариант (EBFP) в сочетании с EGFP, предназначенный для возбуждения источником ультрафиолетового света. К сожалению, относительно плохие фотофизические свойства EBFP, наряду с потенциальной фототоксичностью коротковолнового освещения, сделали эту комбинацию непрактичной. Новые варианты синего флуоресцентного белка могут воскресить эту стратегию спаривания для краткосрочных наблюдений, но им по-прежнему будет препятствовать потребность в высокоэнергетическом возбуждении, которое не позволит использовать синие флуоресцентные белки для долгосрочной визуализации.Наиболее эффективной парой флуоресцентных белков FRET остается высокоэффективный вариант ECFP в качестве донора, связанный с высокоэффективным вариантом EYFP в качестве акцептора. Другие пары включают EGFP или производное EYFP в качестве донора для оранжевых и красных вариантов, таких как мономерный Kusabira Orange или mCherry. Среди проблем, связанных с применением оранжевых и красных флуоресцентных белков (все они получены из рифовых кораллов и морских анемонов) в качестве акцепторов FRET, являются длинные хвосты возбуждения, представленные в спектральных профилях поглощения.Во многих случаях спектры поглощения простираются в голубую и зеленую области спектра, что приводит к прямым артефактам возбуждения акцепторов.

Свойства пар флуоресцентных белков для спектральной визуализации FRET

Флуоресцентный
Белок
Пара
Донор
Возбуждение
Максимум
(нм)
Приемник
Излучение
Максимум
(нм)
Донор
Quantum
Выход
Акцептор
Коэффициент угасания
Коэффициент
Förster
Расстояние
(нм)
Яркость
Коэффициент
EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57 500 4,8 1: 2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83400 4,9 1: 4
Церулеанско-Венера 440 528 0.62 92 200 5,4 1: 2
MiCy-mKO 472 559 0,90 51 600 5,3 1: 2
TFP1-m Вена 492 528 0.85 92 200 5,1 1: 1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104 000 5,1 1: 4.5
EGFP-mCherry 507 510 0.60 72 000 5,1 2,5: 1
Венера-mCherry 528 610 0,57 72 000 5,7 3: 1
Venus-tdTomato 528 581 0.57 138 000 5,9 1: 2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41 000 5,2 13: 1
Таблица 1

Недавнее расширение цветовой палитры флуоресцентных белков для создания вариантов, обладающих широким спектром спектральных профилей, в сочетании с усложнением конструкции белковых химер (слияния, а также биосенсоры) привело к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые являются потенциально полезно в экспериментах FRET (см. Таблицу 1).Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция, как кратко обсуждается выше), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком. Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках.Методы измерения FRET

В связи с тем, что практически все комбинации флуорофоров, используемые для мониторинга FRET, затруднены отдельными и часто уникальными проблемами, которые усложняют их применение для этого метода, для исследователя критически важно полностью понять методологию, в соответствии с которой FRET используется. измеряется. Исследователи должны использовать как можно больше различных методов измерения при проведении пилотных экспериментов с новыми комбинациями FRET с биологическими последствиями.После того, как система была настроена, а результаты согласованы и хорошо поняты, простейшие экспериментальные подходы могут быть использованы для дополнительных измерений. Несмотря на то, что для измерения FRET было разработано большое количество методов, многие из них очень сложны и требуют оборудования, которого нет в большинстве центров микроскопии керна. Наиболее практичные подходы к измерению FRET ограничиваются несколькими методами, которые будут рассмотрены ниже.

Высокая степень спектрального перекрытия между профилями излучения донора и поглощения акцептора, необходимая для FRET, также создает значительный уровень фонового шума, который может существенно мешать обнаружению сигналов FRET.Как обсуждалось ранее, спектральное просвечивание, возможно, является основной проблемой при разделении сигналов FRET для анализа. И донор, и акцептор обычно вносят свой вклад в просачивание, которое может быть обнаружено в канале FRET. Просачивание от донора происходит из-за перекрытия профилей излучения флуоресценции донора и акцептора, которые часто очень широкие (более 100 нанометров) и их трудно разделить. Напротив, просачивание из акцептора происходит в результате прямого возбуждения акцепторных флуорофоров освещением, которое используется для возбуждения донора и образования FRET.Большое количество других источников шума также может испортить измеряемый сигнал FRET. К ним относятся автофлуоресценция, детектор микроскопа и оптический шум, а также вариации спектральной чувствительности в донорных и акцепторных каналах. В результате наиболее полезный подход к измерению точных сигналов FRET требует применения методологии, которая может либо избежать, либо успешно удалить загрязняющие фоновые сигналы.

«утечки сигнала» можно в значительной степени избежать, используя методы FRET, такие как фотообесцвечивание акцептора (также обычно называемое декухшингом донора ; см. Рисунок 5) и микроскопию визуализации времени жизни флуоресценции ( FLIM ), но эти методы также могут вводить другие ограничения.Метод фотообесцвечивания акцептора используется для определения эффективности FRET путем измерения величины подавленного донорного сигнала (рис. 5 (а)) в присутствии акцептора с последующим измерением ослабленного донорного сигнала после того, как флуоресценция акцептора была разрушена посредством фотообесцвечивание (рис. 5 (б) и 5 ​​(в)). Основная концепция фотообесцвечивания акцептора FRET заключается в том, что флуоресценция донора тушится в результате резонансной передачи энергии акцептору. В результате фотообесцвечивание акцептора увеличивает флуоресценцию донора из-за потери эффекта тушения.Таким образом, если FRET происходит между донором и акцептором, флуоресценция донора должна увеличиваться, когда акцептор эффективно удаляется после фотообесцвечивания. Одним из преимуществ фотообесцвечивания акцепторов является то, что каждая исследуемая клетка служит своим собственным контролем, что делает этот метод одним из самых точных для измерения FRET.

Основная задача при выполнении измерений FRET фотообесцвечивания акцептора заключается в том, чтобы убедиться, что донор также не подвергается фотообесцвечиванию, и что акцептор фотообесцвечивается (по крайней мере) примерно до 10 процентов от его первоначального значения.Любое фотообесцвечивание донора приведет к недооценке эффективности FRET из-за потери сигнала. Кроме того, поскольку акцептор необратимо фотообесцвечивается (фактически разрушается), методика фотообесцвечивания акцептора не может быть повторена на одной и той же ячейке. Кроме того, из-за высокой фотостабильности, которую демонстрируют многие флуоресцентные белки, фотообесцвечивание акцептора может занять несколько минут и менее полезно для динамических измерений в живых клетках. Измерения фотообесцвечивания акцептора также могут быть скомпрометированы, если вся ячейка не будет отбелена за один этап.Фотообесцвечивание выбранной области цитоплазмы позволяет притоку свежих флуорофоров в обесцвеченную область, что увеличивает время, необходимое для обесцвечивания всех акцепторных молекул в клетке. Помимо этих проблем, фотообесцвечивание акцептора по-прежнему широко используется для определения эффективности FRET и обеспечивает отличный контроль после проведения экспериментов, основанных на альтернативных методах.

Мониторинг времени жизни донорной флуоресценции в экспериментах FRET можно использовать, чтобы избежать многих проблем, часто встречающихся при методах фотообесцвечивания акцепторов.FLIM, пожалуй, самый строгий метод, используемый для измерения FRET, и он менее склонен к просачиванию артефактов, поскольку измеряет только колебания флуоресценции донора. Все флуорофоры, включая флуоресцентные белки, демонстрируют экспоненциальное затухание их флуоресцентного излучения, которое можно измерить в наносекундной шкале времени. Скорость этого экспоненциального затухания чувствительна к любым процессам, влияющим на возбужденное состояние, включая множество переменных окружающей среды, которые могут гасить флуоресценцию.Таким образом, основная концепция, связанная с FLIM, связана с фотообесцвечиванием акцептора в том смысле, что его можно использовать для обнаружения изменений времени жизни донорной флуоресценции, которые сопровождают передачу энергии акцептору. Фактически, флуоресценция донора гасится FRET, и степень этого гашения может быть определена путем измерения изменений времени жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора.

Комбинация FLIM с FRET может облегчить проблемы с артефактами прямого возбуждения акцептора, которые усложняют другую методологию, и этот метод также можно использовать для мониторинга FRET с использованием акцепторов, которые сами по себе не являются флуоресцентными.Однако у FLIM есть ограничения, которые не позволяют ему стать самым популярным методом для получения изображений FRET. Главное соображение заключается в том, что наносекундные измерения срока службы чрезвычайно сложны и должны проводиться с использованием дорогостоящих приборов, которые не являются широко доступными. Кроме того, FLIM часто требуется несколько минут для сбора каждого изображения, что сильно ограничивает его применение для быстрых динамических событий. Еще одно осложнение — это многоэкспоненциальные кривые спада времени жизни, которые обычно встречаются у многих флуорофоров, которые обычно требуют более всеобъемлющих стратегий сбора данных и усложняют анализ FRET.Наконец, измерения FLIM чувствительны к факторам окружающей среды за пределами FRET, которые могут сократить измеряемый срок службы, включая автофлуоресценцию, вязкость, изменения pH и присутствие ионов металлов. Все только что описанные переменные снижают эффективность использования только методов акцепторного фотообесцвечивания и FLIM, однако они представляют собой важные средства контроля для проверки измерений FRET, полученных другими методами.

Самый простой и простой метод измерения FRET известен как сенсибилизированное излучение (в литературе обычно называется двухцветным ратиометрическим изображением ; см. Рисунок 6), который может быть выполнен на стандартном широкоугольном микроскопе, оборудованном соответствующей флуоресценцией. наборы фильтров.При сенсибилизированной эмиссии донорный флуорофор возбуждается определенной полосой длин волн, и сигнал собирается с использованием двух наборов эмиссионных фильтров, настроенных на флуоресценцию донора или акцептора. Этот метод может дать результаты очень быстро (ограниченный только ограничениями переключения колес фильтров) и поэтому весьма полезен при динамической визуализации живых клеток. В том маловероятном случае, когда не происходит просачивания между возбуждением и испусканием двух флуорофоров, сенсибилизированное излучение будет преобладающим методом измерения FRET.К сожалению, просачивание обычно является значительной проблемой, особенно при использовании флуоресцентных белков, а сенсибилизированное излучение требует обширных контрольных экспериментов, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Кроме того, эти элементы управления должны подвергаться значительной обработке изображения, чтобы вычесть проступание, ограничение, которое замедляет время сбора данных, увеличивает уровень шума и вносит относительно высокую степень неопределенности в измерения.

На рис. 6 представлена ​​серия изображений, полученных при широкоугольном флуоресцентном освещении кальциевых волн, проходящих через цитоплазму клеток карциномы человека ( HeLa ), экспрессирующих циркулярно пермутированный вектор камелеона YC3.60. Этот биосенсор содержит варианты ECFP и EYFP, которые содержат белок кальмодулин и кальций-кальмодулин-связывающий домен киназы легкой цепи миозина ( M13 ) в линейной химере. В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками. На рисунке 6 (а) представлено реальное цветное изображение двух соседних клеток перед добавлением гистамина для индукции связывания кальция с биосенсором.На рисунках с 6 (b) по 6 (h) показаны изображения в псевдоцветном соотношении кальциевых волн, распространяющихся через цитоплазму двух клеток HeLa. Обратите внимание, что волна распространяется сверху вниз в верхней ячейке и справа налево в нижней ячейке. Общее время прохождения кальциевой волной цитоплазмы в этих клетках составляло приблизительно 1,5 секунды. Уровень FRET указывается путем сравнения логометрических псевдоцветов с легендой, представленной на рисунке 6 (а). Изображения на рисунке 6 были получены с использованием двухдиапазонного дихроматического светоделителя, соединенного с фильтрами возбуждения и излучения, настроенными на оптимальные диапазоны длин волн для визуализации ECFP и EYFP с минимальным просачиванием.

Был описан ряд корректирующих подходов для сенсибилизированного излучения с использованием нескольких различных комбинаций фильтров с контролями, которые содержат только донор, только акцептор или образец FRET как с донором, так и с акцептором. Элементы управления позволяют исследователю определить уровень просачивания возбуждения и излучения и вычесть его из измерения FRET. Однако из-за всех необходимых поправочных коэффициентов количество шума в окончательном FRET-изображении может превышать уровень сенсибилизированного излучения в ситуациях, когда взаимодействие между донором и акцептором является слабым.Спектральная визуализация в измерениях FRET

В приложениях FRET построение спектральных изображений можно рассматривать как разновидность метода сенсибилизированного излучения, основанного на возбуждении только донора с последующим получением всего спектра излучения как донорной, так и акцепторной флуоресценции вместо сбора данных по двум независимым каналам. До появления лазерных сканирующих конфокальных микроскопов, предназначенных для получения спектральных изображений, методика в основном ограничивалась спектроскопическими экспериментами с использованием кювет и очищенных флуорофоров.Спектральная визуализация FRET предполагает, что сбор всего спектра флуоресценции позволит разделить перекрывающиеся спектральные профили в соответствии с различными формами спектров, а не просто контролировать интенсивность излучения в ограниченной области полосы пропускания с использованием фильтра. Таким образом, собирая весь спектр как от донора, так и от акцептора (см. Рисунок 7 (a)), можно с помощью спектральной визуализации определить уровни флуоресценции донора и акцептора и на основе этой информации (в сочетании с контролями) вычислить эффективность FRET.

На фиг. 7 представлено логометрическое измерение спектральной визуализации для флуоресцентного белкового биосенсора кальция, известного как cameleon YC3.60, как описано выше. Спектральные профили YC3.60 в присутствии (красная кривая; рис. 7 (а)) и отсутствии (желтая кривая) кальция демонстрируют высокий динамический диапазон зонда при 530 нанометрах. Мультяшные рисунки биосенсора Cameleon представлены в присутствии (Рисунок 7 (b)) и в отсутствие (Рисунок 7 (c)) кальция, чтобы проиллюстрировать, как щелочной металл вызывает конформационные изменения в M13, чтобы переместить две флуоресцентные белковые части ближе друг к другу. .Лямбда-стек изображений с 10-нанометровыми интервалами клеток, экспрессирующих камелеон в присутствии высокой концентрации кальция, показан на рисунке 7 (d). Обратите внимание, что самые высокие интенсивности наблюдаются для лямбда-плоскости, содержащей длины волн излучения от 530 до 540 нанометров.

Сравнение спектрального изображения с линейным несмешиванием и сенсибилизированного излучения с двумя длинами волн возбуждения для определения FRET показывает, что отношение сигнал / шум для методов сенсибилизированного излучения ниже, чем у спектрального изображения (хотя это не всегда так и зависит от сильно зависит от параметров и конфигурации прибора).Это несоответствие связано с тем, что фильтры излучения с относительно узкой полосой пропускания, необходимые для отделения излучения от близко перекрывающихся флуорофоров, блокируют большинство используемых фотонов, которые в противном случае обнаруживаются с помощью спектральной визуализации. Отказ от большого количества выбросов приводит к значительной потере информации, которая в некоторых случаях приближается к 50 процентам имеющихся данных. Кроме того, спектральная визуализация обеспечивает оптимальное взвешивание в соответствии с шумом, присутствующим в отдельных каналах данных, в отличие от традиционных методов (часто произвольно отбрасываемых).Спектральная визуализация требует предварительного определения уровня просачивания из-за прямого возбуждения акцептора, но метод может выиграть от использования двух длин волн возбуждения с инструментами, которые так оснащены.

Конфокальные микроскопы

для получения спектральных изображений, оснащенные акустооптическими перестраиваемыми фильтрами ( AOTF, ) и специализированными детекторными системами, могут использоваться для получения серии изображений в дискретных ограниченных диапазонах длин волн для генерации так называемых лямбда-сумм (изображения боковых ( x, y ) как функция длины волны).Спектральные сигнатуры ( эмиссионных отпечатков пальцев, ) для отдельных флуорофоров или флуоресцентных белков и загрязняющих фоновых сигналов (таких как автофлуоресценция) получают в результате деконволюции стэков лямбда. Метод линейного несмешивания может быть применен к лямбда-сумме для разделения вкладов отдельных сигналов флуорофора в каждый пиксель полученного изображения. Таким образом, спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием может определять и устранять вклад просачивания донора в сигнал FRET.Однако из-за того факта, что флуоресцентное излучение, вызванное прямым возбуждением акцептора (называемое просачиванием акцептора, см. Выше), идентично по спектральным характеристикам сигналу флуоресценции, производимому FRET, необходимо разработать элементы управления, которые помогают определить и устранить вклад акцепторного просачивания, чтобы получить эффективность FRET. Спектральную визуализацию также можно комбинировать с фотообесцвечиванием акцептора или использовать для изучения динамических изменений эффективности FRET в флуоресцентных белковых биосенсорах без использования контроля.Последняя стратегия, пожалуй, наиболее широко применяемый метод исследования FRET с помощью спектральной визуализации.

Для устранения просвечивающего излучения акцептора из-за перекрестного возбуждения в приложениях FRET для получения спектральных изображений большинство подходов основано на предположении, что при отображении в идентичных условиях динамика этих артефактов будет по существу одинаковой в контрольных ячейках, которые экспрессируют только акцептор (по сравнению с экспериментальными клетками, которые экспрессируют как донор, так и акцептор).Однако из-за того, что разные ячейки используются для определения вклада проступания в экспериментальных ячейках, отдельные местоположения пикселей нельзя сравнивать напрямую. В большинстве случаев можно сравнить пиксели как в контрольных, так и в экспериментальных клетках, которые имеют совпадающие уровни флуоресценции. Этот метод основан на алгоритме, который определяет уровни флуоресценции пиксель за пикселем и устанавливает уровень проступания в контрольных клетках, которые экспрессируют только акцептор.Эти контрольные значения проступания затем применяются в качестве поправочного коэффициента к соответствующим совпадающим пикселям в экспериментальных ячейках, которые выражают как донорные, так и акцепторные флуорофоры.

В парах FRET флуоресцентных белков, которые сконструированы с вариантами голубого и желтого флуоресцентных белков (ECFP и EYFP), для получения спектрального изображения требуется возбуждение голубого варианта с использованием лазерной спектральной линии, которая перекрывается с профилем поглощения флуоресцентного белка. В современных конфокальных микроскопах используются диодные и газовые лазеры со спектральными линиями 405, 440 и 458 нанометров, каждый из которых полезен для возбуждения голубых флуоресцентных белков.Однако спектральная линия длиной 458 нм от аргон-ионного газового лазера приводит к значительному просачиванию акцептора (примерно 20 процентов) в канал FRET для пар ECFP-EYFP. Напротив, диодные лазеры с длиной волны 405 и 440 нм будут генерировать меньше проступания (примерно 4 и 8 процентов, соответственно), но загрязняющий сигнал от прямого акцепторного возбуждения все равно должен быть удален для точного расчета сигнала FRET. После установления соотношения интенсивностей изображения донора в присутствии ( I DA ) и отсутствии ( I D ) акцептора эффективность FRET может быть определена с помощью следующего соотношения:

E FRET = 1 — (I DA / I D )

Расчет эффективности FRET таким образом был подтвержден с использованием пар флуоресцентных белков FRET, которые были слиты вместе с короткими пептидными линкерами, а также гораздо более сложной задачи исследования FRET между зондами, которые экспрессируются отдельно.Результаты показали очень похожие значения эффективности FRET при сравнении спектральной визуализации с методологией на основе интенсивности и FLIM. Однако спектральная визуализация позволяет избежать потенциальных проблем, связанных с просачиванием акцепторного сигнала в донорный канал, что является обычным явлением для сенсибилизированной эмиссии на основе фильтров и визуализации с многофотонным возбуждением. Следует обратить внимание на то, что компонент спектрального просвечивания акцептора часто является незначительным и может создавать проблемы при количественной оценке уровня сигнала при использовании детекторов с фотоумножителями, которые имеют нестабильный отклик при очень низких значениях интенсивности.Этот артефакт можно преодолеть, определив просачивание на разных уровнях интенсивности в контрольных ячейках.

Перекрестного возбуждения акцептора можно избежать, выбирая пары FRET флуоресцентного белка, у которых есть донор с большим стоксовым сдвигом. Например, mT-Sapphire и mAmetrine являются производными GFP, которые поглощают свет в ультрафиолетовых длинах волн (примерно 400 нанометров), но излучают либо в зеленой (510 нанометров), либо в желтой (530 нанометров) областях спектра.Когда эти доноры соединены с оранжевыми или красными флуоресцентными акцепторами белка, возбуждение пары FRET вызывает скудное просачивание акцептора и не требует поправочных факторов или контролей. Например, соединение производной GFP, известной как GFP2, с EYFP привело к образованию пары FRET, которую можно возбудить с помощью диодного лазера с длиной волны 405 нм и успешно наблюдать с помощью спектральной визуализации. Поскольку GFP2 и EYFP имеют сильно перекрывающиеся спектры излучения, линейное разделение данных FRET позволяет определить вклад каждого флуорофора в общее излучение флуоресценции.Аналогичным образом, связывание мАметрина с тандемно-димерным томатом (tdTomato) дает пару FRET, которая излучает оранжево-красную флуоресценцию при возбуждении на 405 нм. Возбуждение только tdTomato на этой длине волны практически не дает детектируемого сигнала, поэтому при использовании этой пары поправка на просачивание акцептора не требуется. Подобные пары FRET, вероятно, дадут идентичные результаты.

Из-за неспособности конфокальной микроскопии спектральной визуализации различать эмиссионный сигнал акцептора, генерируемый посредством FRET, и сигнал, происходящий от прямого возбуждения акцептора в флуоресцентном белке и других парах флуорофоров, которые имеют сильно перекрывающиеся спектральные профили, необходимые для FRET, несколько исследователей объединили спектральная визуализация с использованием методов фотообесцвечивания акцепторов для определения эффективности FRET.На рисунке 8 показан пример спектральной визуализации флуоресцентных белков с фотообесцвечиванием акцептора для анализа FRET. Флуорофор представляет собой химеру mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. При экспрессии в клетках млекопитающих (почки кролика) вектор слияния распространяется по цитоплазме и проникает в ядро. Спектральное изображение выраженного вектора в клетках, полученное от 450 до 650 нанометров, представлено на рисунке 8 (а), а изображения эмиссии mCerulean и mVenus с разрешенным спектром показаны на рисунках 8 (b) и 8 (c), соответственно.После фотообесцвечивания mVenus в ячейке, показанной в нижней части окна светом 514 нанометров (Рисунок 8 (f)), флуоресцентное излучение mCerulean увеличивается (Рисунки 8 (d) и 8 (e)) как следствие донорства. обезвоживание.

Фотообесцвечивание акцептора обычно достигается с помощью лазерной спектральной линии, которая перекрывает область с высоким коэффициентом экстинкции (как можно ближе к пику) в спектре поглощения акцептора. Например, в комбинации ECFP-EYFP FRET для фотообесцвечивания EYFP обычно используется 514-нанометровая аргонно-ионная лазерная линия, тем самым уменьшая гашение ECFP с последующим увеличением донорного сигнала (рисунки 8 (d) -8 (f)).Поскольку EFYP постепенно фотообесцвечивается, лямбда-сканирование спектрального изображения проводится с использованием 548-нанометровой линии аргон-ионного лазера (возбуждающего ECFP) между каждым событием фотообесцвечивания для регистрации изменений спектрального отклика. Как правило, лямбда-пакеты собираются в диапазоне длин волн от 465 до 600 нанометров в дискретных полосах пропускания (приблизительно 10 нанометров). Этот экспериментальный подход разработан для минимизации ошибки отдельных измерений путем подгонки изменений интенсивности к стандартной кривой.Значения максимального увеличения интенсивности ECFP можно затем экстраполировать из этой кривой, даже если EYFP никогда не подвергается фотообесцвечиванию полностью. Конечная цель — избежать повреждения живых клеток и нежелательного фотообесцвечивания ECFP в ходе эксперимента. Методы фотообесцвечивания акцептора дают оптимальные результаты, когда донор является фотостабильным, а акцептор — фотолабильным. Эту ситуацию можно контролировать, выбирая подходящие варианты флуоресцентного белка, такие как Cerulean и Venus.

Чтобы рассчитать эффективность FRET с использованием метода фотообесцвечивания акцептора, необходимо выполнить ряд шагов в стратегии анализа данных. Первый шаг состоит из линейного разделения компонентов ECFP и EYFP (или других флуорофоров, если они используются вместо них). Затем за измерением средней интенсивности доноров ECFP и акцепторов EYFP следует расчет изменений интенсивностей для определения эффективности FRET. После получения стопок лямбда используется линейное размешивание для создания изображений донора ECFP и акцептора EYFP из стопок.Общий успех линейного разделения зависит от наличия образцов, которые демонстрируют хорошее отношение сигнал / шум, и использования эталонных спектров, которые точно представляют спектры, содержащиеся в образце FRET. В большинстве случаев клетки, экспрессирующие только ECFP или EYFP (контроль), используются для генерации эталонных спектров. Контрольные спектры должны быть получены в тех же условиях, что и для образца FRET, включая настройки усиления, смещение, диапазон длин волн, объектив и дихроматическое зеркало. Изображения должны быть получены с минимальной насыщенностью сигнала и минимальной интенсивностью пикселей, установленной чуть выше нуля, чтобы получить максимально возможный динамический диапазон.После вычитания фона эффективность FRET рассчитывается с использованием приведенного выше уравнения, где ( I DA ) и ( I D ) представляют собой нормированные интенсивности донора до и после 100-процентного фотообесцвечивания акцептора. В связи с тем, что EYFP почти никогда не обесцвечивается полностью, значение для ( I D ) обычно экстраполируется из линейной аппроксимации графика, описывающего процентное увеличение выбросов ECFP по сравнению с процентным уменьшением EYFP.Технику фотообесцвечивания акцептора можно использовать с другими парами флуоресцентных белков (такими как EGFP и mKusabira Orange) аналогичным образом.

Уникальный подход к измерению FRET с помощью спектральной визуализации получил название lambda FRET и оказался высокоспецифичным, чувствительным и надежным методом анализа резонансной передачи энергии в живых клетках. Алгоритм лямбда FRET основан на отображении образца FRET на нескольких длинах волн излучения с последующим разделением спектра FRET на его донорные и акцепторные компоненты для получения пиксельного расчета эффективности FRET.Lambda FRET применяет новую процедуру предварительной калибровки для коррекции спектрального просвечивания, основанную на получении эталонных отраженных изображений, и была подтверждена с использованием синтетических флуорофорных стандартов FRET (таких как Alexa Fluor 488 и Cy3), а также слияния флуоресцентных белков. (ECFP и EYFP) с переменной длиной линкера и стехиометрией. Уникальная процедура коррекции, основанная на использовании отраженных изображений для нормализации для различной интенсивности излучения, в принципе аналогична методам сенсибилизированного излучения, но дает результаты с меньшим шумовым загрязнением.Было продемонстрировано, что лямбда FRET может быть полезен в случаях, когда высокое спектральное перекрытие и артефакты автофлуоресценции присутствуют как в сценариях визуализации фиксированных, так и живых клеток.

Помимо изучения межмолекулярных взаимодействий и определения эффективности FRET с использованием методов фотообесцвечивания акцепторов и коррекции просвечивания, спектральная визуализация оказалась очень полезной для исследования флуоресцентных белковых биосенсоров для определения наличия или отсутствия FRET в ответ на биологический стимул. .Методология требует получения спектра биосенсора в присутствии и в отсутствие стимулятора, чтобы определить, наблюдается ли FRET или нет, и контролировать динамический диапазон ответа (см. Рисунок 7). Таким образом, творчески объединив пары флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов или другой биологической активности, ряд исследователей разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для визуализации важных оптических живых клеток. метаболические и сигнальные процессы.Обычно два флуоресцентных белка (обычно голубой и желтый варианты) вставляются на противоположных концах сенсорного белка или пептидной последовательности (см. Фиг. 9), как кратко описано выше. Изменения конформации сенсорного белка вызывают соответствующие третичные изменения в структурной организации комплекса и, таким образом, в уровне FRET, который может наблюдаться между фланкирующими флуоресцентными белками. Ратиометрическое изменение выхода флуоресценции донора и акцептора с использованием одного параметра возбуждения в сочетании со спектральной визуализацией становится популярной методологией для исследования этих биосенсоров.

На рисунке 9 представлена ​​карикатура, иллюстрирующая общие стратегии построения флуоресцентных белковых биосенсоров. Голубые цилиндры представляют собой CFP, серые цилиндры представляют собой YFP без FRET, а желтые цилиндры представляют YFP с FRET. Синие молнии указывают на возбуждение на 450 нм, а параллельные волны — на флуоресцентное излучение (на 475 нм, голубой; или 530 нм, желтый). Сенсорные домены имеют телесный цвет, а эффекторные агенты — сферы или эллипсы. На рисунке 9 (a) показан межмолекулярный FRET между отдельным сенсорным доменом и субстратом, слитым с CFP и YFP, соответственно, а на рисунке 9 (b) изображен флуоресцентный белковый биосенсор с одним сенсорным доменом и эффекторным лигандом.Связывание субстрата с сенсорным доменом на рисунке 9 (a) вызывает FRET, тогда как связывание лиганда на рисунке 9 (b) вызывает конформационные изменения в сенсорном домене, чтобы привести флуоресцентные белки в правильную близость для передачи энергии (см. Также Рисунки 7 (б) и 7 (в)). В некоторых случаях домены субстрата и сенсорного белка связаны (рисунок 9 (c)) для создания единой генетической единицы экспрессии для внутримолекулярного FRET, в отличие от ситуации на рисунке 9 (a). Флуоресцентный белковый биосенсор, который обнаруживает расщепление субстрата (рис. 1 и рис. 9 (d)), работает путем устранения FRET после того, как соответствующая протеаза была индуцирована.Биосенсоры протеазного расщепления являются популярными индикаторами апоптоза.

За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих различные пары FRET. Несмотря на ограничения динамического диапазона, наблюдаемые в некоторых биосенсорах FRET, использующих производные голубого и желтого цветов, использование этих флуоресцентных белков получило широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений, широкой доступности и простоты сравнения с другими датчиками, имеющими аналогичные свойства. .Начинают появляться альтернативные пары FRET, включая голубые и бирюзовые донорные флуоресцентные белки, связанные с желтыми и оранжевыми акцепторными флуоресцентными белками, а также зеленые флуоресцентные доноры белков, связанные с красными флуоресцентными белками-акцепторами. Однако на сегодняшний день полезность флуоресцентных белков, полученных из рифовых кораллов и морских анемонов, ограничена. Несколько многообещающих биосенсоров сопоставляют сапфировое или желтое производное GFP с красным флуоресцентным белком для получения репортера длинного стоксова сдвига, как обсуждалось выше.Без сомнения, появятся усовершенствованные биосенсоры, использующие более точно настроенные комбинации флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов. С этой целью спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием будет по-прежнему рассматривать увеличение нагрузки как один из методов выбора для анализа FRET.

Выводы

Ряд методов был разработан для анализа FRET в флуоресцентных белках, а также в синтетических красителях и квантовых точках.Для визуализации живых клеток спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием обеспечивает надежный метод измерения FRET с использованием флуорофоров с сильно перекрывающимися спектральными профилями, что обычно встречается с образцами FRET. Новые флуоресцентные белковые биосенсоры обещают расширить горизонты динамических исследований субклеточной активности, и спектральная визуализация должна оказаться очень полезным инструментом в этой области. Для дальнейшего совершенствования аналитических методов спектральную визуализацию можно комбинировать с методами фотообесцвечивания на протяжении всего срока службы или акцептора.Кроме того, возможность проведения экспериментов FRET с использованием двух разных акцепторов (имеющих разные спектры излучения) находится в пределах области спектральной визуализации, но гораздо труднее выполнять с использованием традиционной методологии.

FRET-повышенная фотостабильность позволяет улучшить отслеживание отдельных молекул белков и белковых комплексов в живых клетках млекопитающих

Анализ структуры белка

Данные опубликованных кристаллических структур были проанализированы с использованием пакета UCSF Chimera 55 .Программное обеспечение Chimera также использовалось для создания рисунков для этой статьи. Список проанализированных белковых структур выглядит следующим образом: mEos3.2 (PDB ID: 3P8U) 56 , HaloTag (PDB ID: 4KAA) 57 , тег SNAP (PDB ID: 3KZZ) 58 и CENP -Нуклеосома (PDB ID: 3AN2) 44 .

Экспрессия белков mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP-tag

Конструкция mEos3.2-HaloTag была клонирована из плазмид, содержащих mEos3.2 59 и HaloTag (Promega), слитых через короткий линкер (Leu- Glu-Gly-Ser), и вставляли в расщепленный EcoRI / HindIII экспрессионный вектор pET30a с использованием набора для клонирования In-Fusion HD (Clontech).Таким же образом клонировали конструкцию HaloTag-SNAP. Затем проводили сайт-направленный мутагенез вектора mEos3.2-HaloTag для создания слитой конструкции с другой длиной линкера (ΔARRELEGSE).

His-tagged конструкции mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP были экспрессированы в клетках E. coli BL21 (DE3) pLysS путем выращивания литра клеток из 50-мл заквасочной культуры до OD 600 нм 0,7–1,0 в среде LB, содержащей 35 мкг / мл канамицина и 34 мкг / мл хлорамфеникола, перед индукцией экспрессии с использованием 1 мМ IPTG (Melford Laboratories Ltd) в течение 4 ч при 25 ° C.Клетки осаждали и хранили при -20 ° C. Для очистки белка клетки быстро размораживали при 37 ° C и ресуспендировали в трех объемах буфера для лизиса (50 мМ Hepes pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5% глицерин и коктейль ингибиторов протеазы (Roche)) на объем осадка. Затем ресуспензию клеток обрабатывали ультразвуком в течение 13 минут с амплитудой 33% (5 секунд при включении и 10 секунд после выключения) с использованием Sonic Dismembrator (модель 505, Fisher Scientific), остатки клеток осаждали, собирали лизат белка и фильтровали через фильтр 0,45- мкм фильтр.

Слитые белки сначала очищали с помощью аффинной хроматографии на никеле. Белковый лизат ресуспендировали в 5 мл суспензии шариков 50% Ni-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA) (Qiagen), предварительно уравновешенной в буфере (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, pH 8,0) и вращали в течение ночи при 4 ° C. Слитый белок очищали с использованием гравитационной колонки объемом 20 мл (Bio-Rad), промывали тремя объемами колонки промывочного буфера (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазол, pH 8.0) и, наконец, элюировали 10 мл буфера для элюирования (50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, 250 мМ имидазол, pH 8,0). Затем белок диализовали (в 50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, pH 8,0) для удаления имидазола с использованием Vivaspin 500 с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) 5 кДа (Sartorius Stedim Biotech). Затем гибридный белок очищали гель-фильтрацией в буфере, состоящем из 50 мМ NaH 2 PO 4 и 1 М NaCl (колонка 75 мл Sephadex200, GE Healthcare).Для проверки массы белка (65096,8 Да) проводили масс-спектрометрию, а для определения его концентрации использовали аминокислотный анализ. Белок хранили в аликвотах по 500 мкл с концентрацией 1 мг / мл при -80 ° C и повторно очищали с использованием эксклюзионной хроматографии перед маркировкой красителя. Слитые белки (5–10 мкМ) метили лигандами HaloTag-dye или SNAP tag-dye путем их реакции в эквимолярном соотношении при комнатной температуре в течение 1 ч перед очисткой с использованием гравитационной колонки Illustra Nap-5 (GE Healthcare ).Масс-спектрометрия подтвердила, что метка близка к 100%.

Красители HaloTag или SNAP-tag PA-JF 549 и JF 646 были любезным подарком от Люка Д. Лависа (HHMI) 60 .

Характеристика спектров объемной флуоресценции

Спектры объемной флуоресценции были получены с использованием mEos3.2 или PA-JF 549 с красителем JF 646 или без него (15–25 мкМ) с использованием флуоресцентного спектрофотометра (Cary Eclipse). Образец помещали в кварцевую кювету (Hellma Analytics, 3 × 3 мм).Чтобы определить фактическую эффективность FRET белков mEos3.2-HaloTag с различными красителями, спектры излучения были собраны после возбуждения при 532 нм и регистрации флуоресценции в диапазоне длин волн (550-800 нм). Эффективность FRET ( E ) была рассчитана по стандартному уравнению (уравнение 1):

$$ E = 1 — \ frac {{I _ {\ rm D} \ prime}} {{I _ {\ rm D}} }, $$

где \ (I _ {\ rm D} \) — интенсивность флуоресценции одного донорного флуорофора (mEos3.2), а \ (I _ {\ rm D} \ prime \) — интенсивность флуоресценции донор в присутствии акцептора (mEos3.2 \) — фактор ориентации диполя (\ (\ frac {2} {3} \) для свободно вращающихся донорных и акцепторных флуорофоров), \ (Q _ {\ rm D} \) — квантовый выход донора mEos3.2 или PA-JF 549 флуорофоров (0,55 и 0,88 соответственно), n — показатель преломления среды (1,33), а J — интеграл спектрального перекрытия между донорами mEos3.2 или PA-JF 549 и акцепторный JF 646 спектры, рассчитанные для разных длин волн λ с использованием коэффициента экстинкции \ ({\ it {\ epsilon}} _ {\ rm A} \) акцепторного красителя JF 646 (максимальное значение 152000 M −1 см −1 ) (Ур.4 \ mathrm {d} \ lambda. $$

Визуализация времени жизни флуоресценции

Измерения временного коррелированного подсчета одиночных фотонов (TCSPC) были выполнены на системе Leica SP8 STED 3x, дополнительно оснащенной программным обеспечением Single Molecule Detection (SMD) (SymPhoTime версия 5.3.2.2) и оборудование (PicoHarp 300; PHR 800) от PicoQuant. Возбуждение флуоресценции в этой системе осуществлялось с помощью импульсного (80 МГц) настраиваемого лазера белого света (WLL; Super-K; NKT Photonics), в то время как обнаружение флуоресценции осуществлялось с помощью внутреннего гибридного детектора одиночных молекул (Leica HyD SMD).Возбуждение донора осуществляли на длине волны 561 нм с полосой обнаружения 570-620 нм и с использованием водно-иммерсионного объектива 20 × 0,75 NA (HC PL APO CS2) с коэффициентом масштабирования 1 × и скоростью сканирования 400 Гц. , и с накоплением кадров 25 изображений. Фотоактивация / преобразование достигались с использованием лазера 405 нм в течение 1 мин при мощности активации 1,75 кВт / см. 2 в фокальной плоскости объектива до измерения срока службы. Увеличение эмиссии доноров произошло после активации / конверсии, как и ожидалось.Измерения FLIM проводили в трех экземплярах до и после активации / конверсии очищенного белка в 50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, pH 8,0 на 8-луночных μ-предметных стеклах со стеклянным дном (iBidi). Белок прикрепляли к покровному стеклу путем инкубации с поли-L-лизином (Sigma Aldrich) в течение 30 минут, а затем с 5–10 мкМ белка в течение 10 минут. Буфер был заменен, чтобы удалить плавающий белок, а затем визуализация прикрепленного белка была проведена путем фокусирования на покровном стекле. Присоединение было подтверждено визуализацией, чтобы гарантировать, что фотопреобразованные молекулы не диффундируют с течением времени.

Данные о распаде TCSPC после активации / преобразования анализировали с использованием программного обеспечения SymPhoTime (версия 2.1) от Picoquant. В этом анализе мы проанализировали хвост совокупных данных распада TCSPC для всех пикселей изображения с минимальным числом 50 фотонов и с необработанным временным диапазоном 1,5 нс ≤ τ ≤ 7,0 нс. Кривая затухания была подобрана к сумме кривых экспоненциального затухания хвоста, определенных (уравнение 5):

$$ {\ mathrm {I (t)}} = I _ {\ mathrm {Bkgd}} {\ mathrm {+} } \ mathop {\ sum} \ limits_i \ alpha _ie ^ {- t / \ tau _i} $$

где I Bkgd — смещение интенсивности для подсчета фона, а \ (\ alpha _i \) и \ (\ tau _i \) — значения амплитуды и времени жизни для и -й экспоненты, где мы сравнивали аппроксимации для 1 ≤ и ≤ 3 (т.е.е., моно-, би- и трехэкспоненциальные аппроксимации). Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных с помощью байесовского информационного критерия (BIC) 62,63 . Короче говоря, используя этот подход, мы вычислили BIC для каждой модели из (Ур. 6)

$$ \ mathrm {BIC} = \ ln [n] (p + 1) + n \ left ({\ ln \ left [{\ frac {{2 \ pi {\ rm RSS}}} {n}} \ right] + 1} \ right), $$

, где n — количество точек данных, p — это количество свободных параметров для подгонки, а RSS — остаточная сумма квадратов подбора.Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных из (Уравнение 7):

$$ {\ mathrm {Relative}} \; {\ mathrm {Likelihood}} = {\ mathrm {Exp}} \ left [{ \ frac {{{\ mathrm {BIC}} _ ​​{{\ mathrm {Min}}} {\ mathrm {(модель) -}} {\ mathrm {BIC (модель)}}}} {2}} \ right] . $$

Данные для mEos3.2 с JF 646 и без него и PA-JF 549 с JF 646 и без него можно описать двумя временами жизни. Мы определили эффективность FRET ( E ), используя среднее время жизни флуоресценции (уравнение.8):

$$ E = 1 — \ frac {{\ tau _ {{\ rm DA}}}} {{\ tau _ {\ rm D}}}, $$

где \ (\ tau _ {\ rm D} \) — средневзвешенное по амплитуде время жизни флуоресценции одного донорного флуорофора (mEos3.2 или PA-JF 549 ), а \ (\ tau _ {{\ rm DA}} \) — амплитуда средневзвешенное время жизни флуоресценции донора в присутствии акцептора (mEos3.2 – JF 646 или PA-JF 549 –JF 646 ).

Установка микроскопа

В этой работе использовались две сделанные на заказ установки микроскопа, обе из которых описаны ниже.Таблицу с подробным описанием конкретных параметров, используемых для каждого эксперимента, можно найти в дополнительной информации.

Микроскоп 1: использовался инвертированный микроскоп IX71 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре масляного объектива Olympus 1,49 NA 60 × (Plan Apochromat 60 × NA 1,49, Olympus APON 60XOTIRF). Используемые источники света диодных лазеров с непрерывной длиной волны включают 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Oxxius, LaserBoxx 405, 100 мВт).Полное внутреннее отражение достигалось смещением лазерного луча от оси таким образом, чтобы выходящий луч на границе образца был почти коллимированным и падал под углом, превышающим критический угол θ c ~ 67 ° для границы раздела стекло / вода для Визуализация TIRF и немного меньше θ c для визуализации с косоугольным освещением. Это создавало след возбуждения диаметром ~ 50 мкм. Для TIRF плотность мощности на покровном стекле для лазера 561 нм была рассчитана приблизительно равной 0.4 кВт / см 2 измерено с помощью лазерного луча при эпи-освещении. Для косоугольного освещения мощность коллимированных лучей на задней апертуре микроскопа составляла 10 кВт / см 2 и 10–100 Вт / см 2 для лазерных лучей 561 нм и 405 нм соответственно. Лазеры отражались дихроичными зеркалами, которые также отделяли собранное флуоресцентное излучение от пучка TIR (Semrock, Di01-R405 / 488/561/635). Эмиссия флуоресценции собиралась через тот же объектив, а затем дополнительно фильтровалась с использованием комбинации длиннопроходных и полосовых фильтров (BLP01-561R и FF01-587 / 35 для возбуждения 561 нм).Эмиссионный сигнал расширялся с помощью расширителя ахроматического луча 2,5 × (Olympus, PE 2,5 × 125) и, наконец, проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512) с усилением электронного умножения 250 ADU / фотон, работающим в режиме передачи кадров. Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ 64,65 .

Микроскоп 2: использовался инвертированный микроскоп IX73 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре Olympus 1.40 NA 100 × масляный объектив (Universal Plan Super Apochromat, 100 ×, NA 1.40, UPLSAPO100XO / 1.4). Используемые диодные лазерные источники света с непрерывной длиной волны включают 641 нм (когерентный, CUBE 640–100 C, 100 мВт), 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Stradus, Toptica, 405–100, 100 мВт). Визуализация TIRF и косоугольного освещения выполнялась с использованием идентичных дихроичных зеркал и эмиссионных фильтров. Сигнал излучения проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512 Delta) с усилением электронного умножения 250 ADU / фотон, работающий в режиме передачи кадров.Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ 64,65 .

TIRF-характеристика красителей mEos3.2-HaloTag

Покровные стекла из боросиликатного стекла (VWR Int, 22 × 22 мм) очищали для удаления любых флуоресцентных остатков в очистителе аргоновой плазмы (плазма Харрика) в течение 1 часа. Камеры для инкубации с герметичной рамкой (Bio-rad) прикрепляли к покровному стеклу и 50 мкл 0,1% поли-L-лизина (Sigma Aldrich) добавляли в центр камеры на 30 мин; Затем к покровному стеклу, покрытому поли-L-лизином, добавляли 50 мкл 10 нМ белка на 10-15 мин.Образец трижды промывали 50 мкл фильтрованной (шприц-фильтр 0,2 мкм, Whatman, 6780–1302) воды MilliQ, и изображения флуоресценции, собранные в виде видеозаписей из 500 изображений, при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование производилось одиночным импульсом в первом кадре каждого фильма.

Анализ фотофизических параметров

Эксперимент был воспроизведен в лаборатории дважды на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2. Хотя все эксперименты показали схожие результаты, мы решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить возникающие систематические ошибки. от слегка различающихся настроек микроскопа.Мы проанализировали фильмы, собранные в тот же день с микроскопа 1, в которых мы отслеживали 455 и 454 отдельных молекул mEos3.2 и mEos3.2 – JF 646 без Trolox, 990 и 1568 отдельных молекул mEos3.2 и mEos3.2 – JF 646 молекул с 2 мМ Trolox. Учитывая, что 20% одиночных молекул mEos3.2 – JF 646 находились во включенном состоянии значительно дольше, чем одиночные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Все гистограммы были созданы с использованием пакета Origin (OriginLab, Northampton, MA).

Здесь приводится краткое описание программного обеспечения, используемого для анализа данных. Проекция с максимальной интенсивностью первых двух изображений после фотопреобразования использовалась в качестве основы для обнаружения одиночных молекул. К проекции был применен фильтр Лапласа гаусса, и были найдены локальные максимумы. Скрипты для этого доступны на https://github.com/TheLaueLab/blob-detection, а для всех остальных шагов — на https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis. Область с центром на каждом пике с пороговым значением> 600 ADU была извлечена из каждого изображения.Эта область состояла из области сигнала 7 на 7 пикселей и окружающей фоновой области шириной 2 пикселя. Отдельные кадры были упрощены до одномерных трасс путем вычитания среднего покадрового фона из соответствующего кадра, а затем взятия среднего значения всех пикселей в этом кадре. Скрытая марковская модель (с использованием пакета python hmmlearn из https://github.com/hmmlearn/hmmlearn) была настроена с четырьмя состояниями: двумя включенными состояниями, одним выключенным и одним обесцвеченным. Переходы были одинаково вероятны между всеми включенными и выключенными состояниями и 1/10 вероятности из любого включенного состояния в обесцвеченное состояние (переход от обесцвеченного состояния был невозможен).Состояния были инициализированы со средним значением 300 ADU для включенного состояния и 0 для выключенного и обесцвеченного состояний, с предварительным весом 1e3, присвоенным среднему состоянию. Модель была обучена на всех следах от определенного флуорофора, и та же обученная модель использовалась для категоризации всех следов.

Общее время в открытом состоянии каждой молекулы было рассчитано путем подсчета количества изображений в открытом состоянии. Мигание было определено как серия последовательных изображений; средняя длина цикла, умноженная на время воздействия, представляет собой время включения, а количество циклов, обнаруженных для конкретной молекулы, представляет собой количество событий переключения.Частота выключения — это количество миганий, разделенное на общее время включения, а скорость включения — это количество миганий, разделенное на общее время выключения (исключая последний запуск вне кадра, если он продолжался до конец видео).

Наконец, было вычислено полное излучение фотонов для каждого изображения, вычитая среднее значение области фона из области сигнала. Чтобы рассчитать количество испускаемых фотонов на молекулу, общее усиление камеры в аналого-цифровых единицах (ADU) / фотон было определено по формуле (Ур.9)

$$ G _ {{\ rm total}} = \ frac {1} {{G _ {{\ rm camera}}}} \ times G _ {{\ rm EM}} \ times {\ rm QE}, $$

где G камера — это усиление сигнала, присущее EMCCD в единицах ADU / электрон, G EM — это соотношение заряда камеры с усилением и без него, а QE — это коэффициент усиления. квантовая эффективность — способность камеры производить заряд в результате падающего фотона с единицами электронов / фотонов. G итого это 33.1 ADU / фотон и 35,7 ADU / фотон для микроскопов 1 и 2 соответственно.

Измеренный сигнал ( I ) в единицах электронов был преобразован в испускаемые фотоны ( n ) следующим образом (уравнение 10):

$$ n = \ frac {I} {{G _ {{\ rm total}} \ times {\ rm TE}}}. $$

TE определяется как эффективность передачи всех оптических компонентов на пути излучения прибора и может быть описана формулой (11)

$$ { \ rm TE} = \ eta _ {{\ rm coll}} \ times T \ times \ eta _ {{\ rm EMCCD}}, $$

, где η coll — эффективность сбора объективом, T — это пропускание внутренних оптических компонентов микроскопа, а η EMCCD — квантовая эффективность EMCCD 66 .

Культура клеток млекопитающих и генерация клеточной линии

ES-клетки культивировали в стандартных условиях сывороточного и мышиного фактора ингибирования лейкемии (mLIF): минимальная необходимая среда Глазго (Sigma-Aldrich G5154), содержащая 100 мМ 2-меркаптоэтанол (Life tech, кат. 21985023), 1 × Minimum Essential Media, незаменимые аминокислоты (Sigma-Aldrich, M7145), 2 мМ L-глутамин (Life tech, кат. 25030024), 1 мМ пируват натрия (Sigma-Aldrich, S8636-100ML), 10% фетальная бычья сыворотка (HyClone FBS, номер партии SZB20006, GE Healthcare Austria SV30180.03) и 10 нг / мл mLIF (предоставлено кафедрой биохимии Кембриджского университета). Их пассировали каждые 2 дня, промывая PBS (Sigma-Aldrich, D8537), добавляя 0,25% трипсин-ЭДТА (Life tech, кат. 25200072) для отделения клеток, а затем промывая в среде перед повторным посевом в свежую среду. Чтобы помочь клеткам прикрепиться к поверхности, планшеты инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,1% желатина (Sigma Aldrich, G1890). Фоновые линии ES-клеток E14tg2a (доступные от Sigma Aldrich, 08021401) были охарактеризованы с помощью количественной ПЦР, RNA-seq, ChIP-seq и анализов активности, и их обычно проверяли на контаминацию микоплазмой и дали отрицательный результат.

ES-клетки, экспрессирующие мышиный CHD4, помеченный на С-конце mEos3.2-HaloTag, генерировались путем нокаута на основе CRISPR / Cas9 кассеты, содержащей mEos3.2-HaloTag и ген селекции пуромицина в один аллель CHD4 клетки ES 37 . Затем кассету пуромицина удаляли с использованием рекомбиназы Dre для генерации аллеля CHD4 с помощью слияния с С-концевым mEos3.2-HaloTag. Поскольку нокаут CHD4 является летальным, мы использовали анализы жизнеспособности клеток, чтобы убедиться, что функция меченого CHD4 не пострадала.Линия ES-клеток E14tg2a 67 , экспрессирующая mEos3.2-tagged CENP-A, была ранее описана 59 , но вкратце была создана путем трансфекции плазмиды, экспрессирующей меченый белок, с последующим отбором в 500 мкг / мл генетицина (Life tech , кат.10131019). После 2 недель отбора генетицина клетки сортировали с использованием проточного сортировщика MoFlo (Beckman Coulter), чтобы гарантировать, что они были помечены флуорофором mEos3.2 (возбуждение при 488 нм, испускание при 515 нм). Чтобы проверить наличие одномолекулярного FRET между mEos3.2 или PA-JF 549 и JF 646 на разных белках, векторы, экспрессирующие CENP-A с тегами HaloTag и SNAP, были созданы путем вставки последовательности тегов HaloTag или SNAP в сайт NcoI / XhoI mEos3.2. -меченый вектор CENP-A, описанный выше 59 . Один только белок HaloTag также экспрессировался в том же векторе, что и контроль. Вектор, экспрессирующий гистон h3B с меткой SNAP, был ранее описан 45 .

Визуализация живых клеток и фиксированных клеток млекопитающих с одной молекулой

ES-клетки, экспрессирующие mEos3.CHD4, меченный 2-HaloTag, пассировали за 2 дня перед визуализацией на 35-миллиметровые чашки со стеклянным дном № 1.0 (MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Case) в сыворотке, не содержащей фенолового красного, и в условиях mLIF. Непосредственно перед визуализацией, если необходимо, клетки метили 5 мкМ лиганда HaloTag-JF 646 в течение не менее 15 минут с последующими двумя промываниями в PBS и 30-минутной инкубацией при 37 ° C в среде перед визуализацией клеток в свежая сыворотка без фенолового красного и условия LIF, содержащие 5 мМ Trolox. Флуоресцентные изображения in vivo собирали в виде видеороликов из 10 000 кадров при экспозиции 500 мс.Непрерывное фотопреобразование было достигнуто с использованием лазера с длиной волны 405 нм при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см 2 .

Для отслеживания белкового комплекса ES-клетки, экспрессирующие SNAP-меченный гистон h3B или mEos3.2-, HaloTag- и SNAP-меченный CENP-A, были созданы путем трансфекции соответствующих экспрессионных векторов. Четыре микролитра Lipofectamine® 2000 (Life tech, cat. 11668027), инкубированных в 100 мкл OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher Scientific, cat. 31985070) в течение 5 минут, добавляли примерно к 2–3 мкг векторы экспрессии, также инкубированные в 100 мкл OPTI-MEM® в течение 5 мин.Затем смесь инкубировали еще в течение 15 мин перед добавлением к ES-клеткам, которые одновременно пассировали на чашки со стеклянным дном 35 мм. Через 2 дня клетки метили с использованием соответствующих лигандов HaloTag, как описано выше для CHD4. Лиганды меток SNAP также были помечены аналогичным образом, но с начальной инкубацией в течение 30 минут до промывки.

FRET был оптимизирован за счет обеспечения избытка акцепторного красителя вокруг донора mEos3.2 или PA-JF 549 . Для FRET между mEos3.2-tagged CENP-A и JF 646 -tagged CENP-A, это осуществляли путем трансфекции 0,4 мкг CENP-A с меткой mEos3.2 или CENP-A с меткой SNAP вместе с 2 мкг CENP-A с меткой HaloTag. А. Для FRET между PA-JF 549 с меткой и JF 646 с меткой CENP-A или PA-JF 549 с меткой h3B и JF 646 с меткой h3B это было достигнуто путем мечения клеток после трансфекции с 0,2 µM SNAP-tag PA-JF 549 лиганд и 2 µM SNAP-tag JF 646 лиганд. Наконец, для CENP-A / h3B FRET — 1 мкг mEos3.2-меченый CENP-A трансфицировали вместе с 1 мкг SNAP-меченного CENP-A и метили 5 мкМ SNAP-tag JF 646 лигандом. Клетки, экспрессирующие конструкцию mEos3.2-CENPA, PA-JF 549 -CENP-A или PA-JF 549 -h3B, были идентифицированы по их способности фотоактивировать отдельные молекулы с использованием лазера 405 нм и клеток, меченных лиганды HaloTag-JF 646 или SNAP tag JF 646 по их локализации в центромерных фокусах или в ядре (для HaloTag-CENP-A или h3B с меткой SNAP, соответственно), как определено с помощью визуализации с использованием лазера с длиной волны 641 нм. (1 кВт / см 2 ).Флуоресцентные изображения фиксированных и живых клеток собирали в виде видеофильмов размером от 3000 до 5000 кадров при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование достигалось с использованием 100 мс экспозиции лазера 405 нм каждые 6 с при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см 2 . Для фиксации клеток клетки промывали PBS, фиксировали при комнатной температуре в PBS, содержащем 4% формальдегид, в течение 15 минут, снова промывали в PBS и затем ресуспендировали в PBS, содержащем 5 мМ Trolox.

Обработка и анализ изображений клеток млекопитающих

Фильмы с живыми клетками и фиксированными клетками одиночных молекул были проанализированы с помощью программного обеспечения Rapidstorm, которое определяет локализации одиночных молекул из фильмов PALM 68 , после использования коррекции фона катящегося шара изображения с радиусом 5 пикселей.Были проанализированы только флуоресцентные точки шириной менее 5 или 3 пикселей (для микроскопов 1 и 2 соответственно) и с фиксированным глобальным порогом выше 25000. Чтобы отслеживать отдельные молекулы CHD4, CENP-A или h3B, мы использовали специальный код для соединения локализаций отдельных молекул и извлечения длины их траекторий (сценарий можно найти на https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis) . Флуоресцентные точки считались одной и той же молекулой, если они находились в пределах 100 нм между кадрами, потому что мы не ожидаем увидеть более высокие коэффициенты диффузии для связанного h3B / CENP-A / CHD4.Молекулы все еще были связаны, если они не были обнаружены в течение 1 кадра, чтобы уменьшить вероятность того, что молекулы на короткое время упадут ниже порога отношения сигнал-шум. Траектории меньше трех локализаций отбрасываются, чтобы снизить вероятность обнаружения шума. Средняя интенсивность этих траекторий также была извлечена для расчетов эффективности FRET — мы игнорируем первый и последний кадры, потому что молекула могла не флуоресцировать на всех этих кадрах. Изображения одиночных молекул, представленные на рис.4 были сгенерированы с использованием Peak Fit, так что локализации представляют точность, с которой они были локализованы 69 . Точность локализации была рассчитана после анализа Rapidstorm путем подбора гистограммы парных расстояний до ближайших соседей 70 .

Для отслеживания живых клеток односвязанных молекул CHD4 эксперимент был воспроизведен дважды на Микроскопе 1 и один раз на Микроскопе 2. Мы снова решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить систематические ошибки, возникающие из-за незначительно отличающихся друг от друга микроскопов. выравнивания.Мы собрали 772 и 539 траекторий одиночных молекул из фильмов одиночных молекул для молекул CHD4 с меткой mEos3.2 и mEos3.2 – JF 646 , соответственно (обычно в каждом фильме изучались две клетки). Учитывая, что 10–30% отдельных молекул mEos3.2 – JF 646 находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения.

Для анализа близости белка FRET CENP-A было собрано больше траекторий, потому что mEos3 относительно мало.Предполагалось, что молекулы с двумя метками будут находиться рядом с молекулами с меткой JF 646 . Эксперимент был воспроизведен один раз на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных из Микроскопа 2, в котором мы собрали 17 953, 17 288 и 21 018 траекторий из одномолекулярных фильмов mEos3.2-CENP-A, mEos3. .2-CENP-A / JF 646 -CENPA и mEos3.2-CENP-A / JF 646 -h3B, соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре клетки). Учитывая, что ~ 0,1–1% mEos3.2 молекулы в присутствии молекул с меткой JF 646 находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер образца для демонстрации наблюдаемых нами изменений.

Для анализа близости h3B FRET эксперимент был воспроизведен дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных, в которых мы собрали 2114 и 3970 траекторий из одномолекулярных фильмов PA-JF 549 -h3B и PA-JF. 549 -h3b / JF 646 -h3B соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре клетки).Учитывая, что 10% молекул PA-JF 549 в присутствии молекул с меткой JF 646 находились во включенном состоянии более 1% от одиночных молекул PA-JF 549 , это подходящий размер образца. чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Траектории длиннее 1% одиночных молекул PA-JF 549 были идентифицированы и окрашены в синий цвет. Эффективность FRET рассчитывалась с использованием средней интенсивности молекул, меченных одним PA-JF 549 . Карты плотности шириной 2 пикселя (312 нм) были созданы, чтобы показать количество молекул, обнаруженных в пределах области, и была ли средняя длина трека ниже (желтый) или выше 12 с (синий), доверительный интервал 1% установлен таким образом, что существует 1% -ная вероятность того, что молекулы, помеченные PA-JF 549 , будут иметь длину трека более 12 с.

Доступность данных

Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у авторов по запросу.

Доступность кода

Программное обеспечение, используемое для фотофизического анализа in vitro и отслеживания живых клеток, можно найти на https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis и https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis , соответственно. Другое используемое программное обеспечение включает микро-менеджер программного обеспечения с открытым исходным кодом (https://www.micro-manager.org), ImageJ64,65, Rapidstorm68 и PeakFit69.

Значение FRET на фото — Что означает FRET на фото? Определение FRET

Значение для FRET — это F & Ouml; Rster Rezonans Enerji Transferi, а другие значения расположены внизу, которые имеют место в терминологии Photo, а FRET имеет одно значение. Все значения, принадлежащие аббревиатуре FRET, используются только в терминологии Photo, другие значения не встречаются. Если вы хотите увидеть другие значения, щелкните ссылку «Значение FRET».Таким образом, вы будете перенаправлены на страницу, где указаны все значения FRET.
Если внизу не указано 1 аббревиатура FRET, выполните поиск еще раз, введя такие структуры вопросов, как «что означает FRET на фото, значение FRET на фото». Кроме того, вы можете выполнить поиск, набрав FRET в поле поиска, которое находится на нашем веб-сайте.

Значение астрологических запросов

FRET Значение на фото

  1. FÖRster Rezonans Enerji TransferiPhoto

Также вы можете найти значение FRET для фото в других источниках.

Что означает FRET для фото?

Мы составили запросы в поисковых системах о аббревиатуре FRET и разместили их на нашем веб-сайте, выбрав наиболее часто задаваемые вопросы. Мы думаем, что вы задали аналогичный вопрос поисковой системе, чтобы найти значение аббревиатуры FRET, и мы уверены, что следующий список привлечет ваше внимание.

  1. Что означает FRET для фото?

    FRET означает FÖRster Rezonans Enerji Transferi.
  2. Что означает аббревиатура FRET на фото?

    Сокращение FRET на фото означает «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».
  3. Что такое определение FRET?
    Определение FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».
  4. Что означает FRET на фото?
    FRET означает, что «FÖRster Rezonans Enerji Transferi» для Фото.
  5. Что такое аббревиатура FRET?
    Акроним FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».
  6. Что такое сокращение от FÖRster Rezonans Enerji Transferi?
    Сокращенное обозначение «FÖRster Rezonans Enerji Transferi» — FRET.
  7. Каково определение аббревиатуры FRET на фотографии?
    Определения сокращенного обозначения FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».
  8. Какова полная форма аббревиатуры FRET?
    Полная форма сокращения FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».
  9. Что означает FRET в фото?
    Полное значение FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».
  10. Какое объяснение FRET на фото?
    Пояснение к FRET — «FÖRster Rezonans Enerji Transferi».
Что означает аббревиатура FRET в астрологии?

Мы не оставили места только значениям определений FRET. Да, мы знаем, что ваша основная цель — объяснение аббревиатуры FRET. Однако мы подумали, что вы можете рассмотреть астрологическую информацию аббревиатуры FRET в астрологии. Поэтому астрологическое описание каждого слова доступно внизу.

FRET Аббревиатура в астрологии
  • FRET (буква F)

    Вы идеалистичны и романтичны, возносите своего возлюбленного на пьедестал.Вы ищете лучшего друга, которого можете найти. Вы флиртуете, но когда-то преданы своему делу, вы очень лояльны … Вы чувственны, сексуальны и страстны в личной жизни. На публике вы можете быть эффектным, экстравагантным и галантным. Вы рождены романтиком. Драматические сцены — ваше любимое времяпрепровождение в фантазиях. Вы можете быть очень щедрым любовником.

  • FRET (буква R)

    Вы серьезный, ориентированный на действия человек. Вам нужен кто-то, кто может идти в ногу с вами, и кто равен вашему интеллекту, чем умнее, тем лучше.Великий ум заводит вас быстрее, чем великое тело. Однако для вас очень важна физическая привлекательность. Вы должны гордиться своим партнером. В личной жизни вы очень сексуальны, но вы не хвастаетесь, вы готовы служить учителем. Секс важен; вы можете быть очень требовательным товарищем по играм.

  • FRET (буква E)

    Ваша самая большая потребность — поговорить. Если ваш партнер не умеет слушать, у вас проблемы с общением. Человек должен быть интеллектуально стимулирующим, иначе вы не заинтересованы в сексе.Вам нужен друг для любовника и компаньон для соседа по постели. Вы ненавидите дисгармонию и разлад, но время от времени вы наслаждаетесь хорошими аргументами, которые, кажется, взбудораживают вас. Вы много флиртуете, потому что вызов для вас важнее полового акта, но когда вы отдаете свое сердце, вы проявляете бескомпромиссную лояльность. Когда у вас нет хорошего любовника, с которым можно заснуть, вы заснете с хорошей книгой.

  • FRET (буква T)

    Вы очень чувствительны, скрытны и сексуально пассивны; вам нравится партнер, который берет на себя инициативу.Музыка, мягкий свет и романтические мысли заводят вас. Вы фантазируете, но не можете легко влюбиться и разлюбить. В любви вы романтичны, идеалистичны, мягки и чрезвычайно сильны. Вам нравится, когда ваши чувства и чувства стимулируются, возбуждаются и дразнят. Ты отличный флирт. Вы можете привести свои отношения в соответствие с вашей мечтой, зачастую все это происходит в вашей голове.

Не волнуйтесь «Жизнь так далеко»: Харрингтон и Рохо вносят свой вклад в новую книгу

НЕ ПОЛУЧАЕТ ЭТО ФРЕТ, И ОН ПОЛУЧАЕТ ВАС.


BSA представляет вводное эссе и фотографии в первый гигантский сборник, представляющий карьеру гениального чикагского юмориста DONT FRET в области уличного искусства.


Dont Fret (фото © Jaime Rojo)

Социологи, антропологи и ребята из художественной школы любят говорить, что художник ведет диалог с улицей, со своими сверстниками и с обществом. Чикагский уличный художник по имени Дон Фрет, более фундаментальный и убедительный, чем большинство других, предлагает вам принять участие в вдумчивом аналитическом диалоге с ним и его персонажами.Он тоже надеется на смех.

После двух с половиной лет подготовки к праздникам DONT FRET представляет свою первую полнометражную книгу о Schiffer Books, и ожидание того стоило.

Хайме Рохо из Бруклинского стрит-арта предоставил фотографии для новой книги, а главный редактор BSA имел честь написать введение. Мы приводим отрывок из этого эссе, чтобы проиллюстрировать опыт DONT FRET:



«Дон’т Фрет, американский рабочий-сатирик по стрит-арту, получивший образование на польском Бродвее, — выдающийся юморист по стрит-арту из Чикаго, автор граффити, документалист и проницательный наблюдатель за обычными людьми и их различными культурами, которые теперь сливаются друг с другом.Благодаря новой мускулистой джентрификации даже они полностью вытесняются более обеспеченными поселенцами. Именно здесь Нельсон Олгрен, «бард пустых и внешних» задокументировал изнанку и дикую сторону Чикаго в 1940-х и 50-х годах в таких книгах, как «Неоновая пустыня» и «Человек с золотой рукой». Как и автор, Don’t Fret включает в свои работы характер улицы. В отличие от Алгрена и более подходящего для этого времени, его работа также является Мета — настоящие персонажи на улице представлены здесь в его искусстве на улице.

He не воссоздает город, он его захватывает. Когда дело доходит до окрестностей Wicker Park, Bucktown и Ukrainian Village в Чикаго, Don’t Fret возрождается его воспоминания, когда он рос там ребенком. У него ярко выраженная психологическая и эмоциональная привязанность к этим местам, даже если морозы шесть месяцев в году, и он считает, что все местные спортивные команды — отстой, в том числе, да, Da Bears.

Dont Fret (фото © Jaime Rojo)

«Мои родители говорили, что я всегда был забавным в детстве и всегда был смутьяном», — говорит он о своем пытливом уме и саркастической речи еще в 3-м классе, когда родители забрали его из школы. государственная школа и поместила его в чартерную школу.«Это была середина 90-х, и чартерные школы были в Чикаго в новинку. Особенность этой школы заключалась в том, что главным благотворителем школы была саудовская нефтяная компания, а большинство учителей школы были бывшими военными. Так что, хотя это и не было военное училище, я определенно чувствовал это », — говорит он. «Я постоянно был в беде и отвечал учителям», что неудивительно.

«Я думаю, что однажды я спросил учителя истории, который был одержим Китаем, не коммунист ли он, или какой-то умный человек.Это очень рано научило меня всегда подвергать сомнению авторитет и свое окружение. Думаю, я нашел юмор и сатиру как способ справиться с темными временами ».« Темные времена », простое точное описание для этой эпохи, начертанное роликом« Не волнуйся »на здании напротив канала в Хакни-Вик, Лондон, а также название его художественного коллектива. Подобно своей работе дома, он изучает обычное употребление и фразы других культур, которые он посещает, чтобы придумать хитроумные повороты слов и передать собственное чувство иронии.

Он признает, что воспоминания о городе в его юности иногда расплывчаты и податливы перед лицом времени и моря джентрификации, которое изменило его окрестности, но он не чувствует давления, чтобы быть абсолютно фактическим, просто точным и правдивым. по его впечатлению. Когда-то четко очерченные этнические анклавы североевропейского, польского и украинского происхождения, введение разделяющей классы автострады и наводнение пуэрториканцев и других латиноамериканцев в 1960-х и 1970-х годах создали водоворот маргинализированных сообществ, которые пытались зарабатывать себе на жизнь. в то время, когда он приехал.«



Dont Fret (фото © Jaime Rojo)

Это город Дон Фретса, и романтизм, вероятно, его погубит. Сурово выглядящие нормальные люди с разной позой и проблемной модой бродят по серым тротуарам вместе и по отдельности. Уличная жизнь разделяется в непредсказуемом ритме повседневности; автобусы и машины с клубами грязи, выходящими из выхлопных труб, суровый гаишник, выписывающий штраф, стоя у машины, мужчина на крыльце из красного кирпича опрокидывает бутылку пива своими пухлыми мультяшными губами.Наши недостатки и нелепые качества подчеркиваются вместе с весельем нашей непримечательности с помощью различных обозначений статуса и культурных деталей, каждое из которых вытесняется нашими странностями.

Работа всегда рядом с едой, еда всегда рядом с пивом, а пиво всегда рядом с Da Bears и The Buff. Да, «Чикаго Бафф»; эта коричневая краска, которая появляется и преследует чикагских граффити-писателей и уличных художников, известна в других городах. У вас всегда будет час рассказов о «Баффе» на любом граффити-барбекю в Чикаго.

«Кто-то однажды сказал, что в жизни есть только две константы: смерть и налоги», — согревает он. «Они явно забыли и о баффе. У меня нет статистики по этому поводу, но если бы я был азартным игроком, я был бы готов поспорить, что город Чикаго тратит больше денег на бафф, чем на общественное искусство, так что это говорит? Было бесчисленное количество раз, когда я выставлял кусок в 2 часа ночи и возвращался, чтобы сфотографировать его в 9 утра, и он уже был окрашен в дерьмо коричневый цвет. Интересно, что они тоже выбрали этот цвет, не так ли? Например, кто получил этот контракт на создание тысяч галлонов дерьмовой краски для распыления по всему городу? »


Два отрывка из эссе «Ты здесь.Не волнуйся «. Стивен П. Харрингтон

Dont Fret (фото © Jaime Rojo) Dont Fret (фото © Jaime Rojo) Dont Fret (фото © Jaime Rojo) Dont Fret (фото © Jaime Rojo) Dont Fret (фото © Jaime Rojo) DONT FRET «Жизнь так далеко» , опубликовано сегодня, 9 декабря, Schiffer

Другие статьи, которые могут вам понравиться от BSA:

Не волнуйтесь, еще есть время для осенних фотосессий!

Аххх осень. Время изменилось, листья поворачиваются, утро свежее, и мы сталкиваемся с непрекращающимися спорами о том, как скоро СЛИШКОМ скоро появятся рождественские украшения.Но это время пришло — мы готовы приступить к осенним фотосессиям, особенно если вы собираетесь отдыхать на природе. Но не нужно плакать, Роли, еще осталось несколько свиданий, и я всегда буду делать все возможное, чтобы увидеть каждое улыбающееся лицо, которое смогу увидеть в это прекрасное время года! Ярлык для календаря доступности здесь: http://smp.rocks/23kLYsl — прочтите некоторые советы по планированию.

Планирование осенних фотографий

Даты ограничены в это время года, осталось всего несколько дней (и выходные забронированы), поэтому планируйте время занятий в будние дни.Я знаю, что в будни бывает сложно совладать с работой и учебой, но считаю это замаскированным благословением; выходные в это время года — полное безумие в местных парках и садах. Бывают дни, когда мы буквально можем ждать в очереди, чтобы получить место для работы, и это создает очень стрессовую ситуацию для маленьких (а также для пап и фотографов).

Я предпочитаю занятия по утрам для семейных занятий с малышами, и даже у более крупных детей перед школой появляется больше энергии, чем после долгих занятий математикой и естественными науками.Время начала зависит от вас; мы можем работать раньше, поэтому ваш рабочий день будет пропущен меньше, если позволяет температура. Конечно, время для сна всегда царит! Дни стали короче, поэтому «вечерние» занятия — это на самом деле дневные занятия; с 5:00 по времени заката у вас не так много места для маневра, поэтому планируйте начать полные занятия к 3:00.

В это время года так много мест, которые выглядят великолепно, что вы можете разместить практически любую обстановку.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *